腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究

李　彪　兰　静　肖　鸣（内江市第一人民医院口腔科内江641000）

腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究

李彪兰静肖鸣（内江市第一人民医院口腔科内江641000）

目的：利用腺病毒载体和脂质体转染脐静脉内皮细胞探讨转染脐静脉内皮细胞的理想条件。方法：分别使用腺病毒载体和Lipofectamine 2000脂质体介导VEGF165基因转染脐静脉内皮细胞。转染后通过倒置荧光显微镜检测转染效率，对比探讨转染脐静脉内皮细胞的理想方法。结果：采用脂质体法转染脐静脉内皮细胞效果不理想，转染率约11.60％。采用腺病毒载体转染率明显高于脂质体法，且随感染复数增加而增加。结论：采用腺病毒介导VEGF165转染脐静脉内皮细胞较脂质体法转染效率高，当M0I= 50时可作为转染安全有效的条件．这为细胞转染技术在脐静脉内皮细胞的研究提供实验基础。

脐静脉内皮 细胞细胞转染 腺病毒载体 脂质体转染

种子细胞的培养是组织工程的基本要素，VEGF是目前已知诱导血管再生作用最强的生长因子，但人工添加VEGF的活性时间短。Hudson N等[1]研究认为如果在正常氧分压下VEGF165的生物半衰期30～45min，在低氧环境下是6～8h。参与血管形成的主要细胞是内皮细胞，通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建形成新的毛细血管网[2]。许多研究证实，通过将特定的目的基因转染到细胞内可以使目的基因长期稳定持续性表达。如能将VEGF基因转导至内皮细胞，使其能保持局部VEGF高浓度活性促进血管再生。转染的关键之一是将VEGF基因安全有效转入靶细胞中并持续表达，因此需要寻求转染脐静脉内皮细胞的合适方法。本实验选择脐静脉内皮细胞为实验对象，用不同腺病毒滴度及不同脂质体浓度转染脐静脉内皮细胞，探讨适合脐静脉内皮细胞转染的有效条件。

1　材料与方法

1.1材料：腺病毒过表达载体pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165以及质粒pIRES-GFP-VEGF165构建（汉恒生物有限公司），HUVECs（Sciencell公司），DMEM培养基（北京赛默飞世尔生物化学有限公司），胎牛血清（FBS）（北京赛默飞世尔生物化学有限公司），二甲基亚砜（美国Sigma公司），0.25％胰蛋白酶（美国Sigma公司），Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）。

1.2脐静脉内皮细胞（HUVECs）的复苏培养：快速将冻存管从液氮罐里拿出，放入37℃水浴锅升温，2min内将冻存管中液体解冻。复温后吸出细胞至15mL离心管，1∶1缓慢加入培养液，离心去除培养液后用新鲜培养液重悬细胞，转移到培养瓶中培养。

1.3脂质体（Lipofectamine 2000）转染脐静脉内皮细胞：脐静脉内皮细胞培养至约80％～90％融合时，消化成细胞悬液，调整细胞数，按1×105个细胞每孔接种到24孔板，加入培养基500μL混匀放进37℃5％CO2培养箱培养24h。细胞贴壁后小心弃掉旧培养基，各孔中加入400μL培养基，按每孔4μg质粒和10μL Lipofectamine 2000脂质体，轻轻摇晃孔板混合后在37℃5％CO2培养箱中培养72h观察转染情况。

转染效率（％）=荧光视野下细胞数/普通视野下细胞数×100％

1.4腺病毒感染脐静脉内皮细胞：脐静脉内皮细胞培养至约80％～90％融合时，消化成细胞悬液，调整细胞数，按1×105个细胞每孔接种到24孔板，加入培养基500μL混匀放进37℃5％ CO2培养箱培养24h。各孔以10、25、50、100的感染复数加入携带VEGF165的腺病毒载体，培养72h后观察转染情况。

转染效率（％）=荧光视野下细胞数/普通视野下细胞数×100％

1.5统计学方法：采用SPSS19.0软件进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1脂质体转染脐静脉内皮细胞：采用脂质体转染脐静脉内皮细胞，转染率低，100倍显微镜下拍照后采用Image-pro Plus软件分析测得荧光蛋白表达量。结果示转染率为11.60％。见图1。

2.2腺病毒转染脐静脉内皮细胞：采用腺病毒转染脐静脉内皮细胞，当MOI=10，25，50时见有少量悬浮死细胞，HUVECs细胞形态无明显变化，在M0I=100有较多悬浮死细胞，HUVECs细胞收缩，变圆，胞核不清，核仁消失。镜下拍照后Image-pro Plus软件分析测得荧光蛋白表达量，结果提示，感染复数为10、25、50、100时转染率分别为10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，转染率明显高于脂质体法，但当感染复数为100时镜下见培养基中有较多漂浮的死细胞。所以M01=50为最佳感染复数。见图1。

3　讨论

细胞转染技术是指将有生物功能的外源性基因片段导入细胞并使其表达的技术。随着细胞生物学及分子生物学等研究的不断发展，其应用越来越广泛。选择理想载体是基因转染的重要环节，合适的载体会有更高的转染效率，因此基因转染需要根据实验条件，选择更好的载体及转染方法。本实验通过腺病毒及脂质体法转染脐静脉内皮细胞，探讨脐静脉内皮细胞转染的理想条件。

目前，用做基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒类载体有4种：逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒以及腺病毒。逆转录病毒只能用于转染分裂期细胞，转染率高、基因表达稳定；慢病毒可转染非分裂期和分裂期细胞，可携带基因片段较长，目的基因表达效率较高，但慢病毒载体的生物安全性低；腺相关病毒是目前可携带外源基因容量最大的，转染效率高，但细胞毒性大；腺病毒载体以其低毒性，相比之下安全性能高，可转染非分裂期及分裂期细胞，宿主范围广，不整合入宿主细胞染色体，可携带的外源性基因量较大等优越性能成为应用最广泛的病毒载体[3]。非病毒载体转染法包括脂质体介导转染、DEAE葡聚糖介导转染、阳离子聚合物介导转染、磷酸钙介导转染及电击基因转导等[4～5]，在非病毒载体中脂质体介导转染法最为常用。本实验采用脂质体介导和腺病毒载体这两种方法转染脐静脉内皮细胞。实验结果发现，脂质体转染法对脐静脉内皮细胞的转染率较腺病毒载体低，在使用腺病毒作为转染载体时转染率随MOI的增加而升高，当MOI=50时，转染率为90.85％。腺病毒是一种线性双链病毒，无包膜，直径60～90nm，广泛分布于自然界。腺病毒可分为禽腺病毒属和哺乳动物腺病毒属，其中人腺病毒是哺乳动物腺病毒属的代表，人腺病毒可分为A-F六种亚型及50多个血清型，其中血清型C组2和5型目前应用较多，常用的腺病毒删除了其中基因组E1区因此可避免肿瘤的发生安全性较高[6]。腺病毒可分为三代：第一代腺病毒载体删除了基因序列中E1和E3表达盒，由于仅E1区缺失它在能够为其提供E1缺失蛋白的宿主细胞时可能会引起细胞病变；第二代腺病毒载体在第一代基础上删除了E2a和E4表达盒修正了不足并降低了免疫性，不过目标基因持续表达时间仍较短；第三代腺病毒载体只保留包装信号和复制信号去除了大部分腺病毒基因，可携带的外源基因较大，持续表达目的基因的时间也大大提高，转染后无病毒自身蛋白表达并且避免了免疫反应，拥有很好的应用前景[7]。腺病毒载体具有许多优点，但MOI过高会造成细胞毒性，本实验中腺病毒载体转染时转染率随MOI增加而增加，感染复数为10、25、50、100时转染率分别为10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，同时在MOI=10、25、50时可见有少量悬浮死细胞，HUVECs细胞形态无明显变化，而在M0I=100有较多悬浮死细胞，HUVECs细胞收缩，变圆，胞核不清，核仁消失，这可能是由于腺病毒载体浓度过高引起宿主细胞中毒。由此可见，当MOI=50时腺病毒载体对脐静脉内皮细胞的转染率高，同时无明显毒性作用，这为脐静脉内皮组织工程的研究提供实验基础。

[1]Hudson N,Powner MB,Sarker MH.Differential apicobasal VEGF signaling at vascular blood-neural barriers.DevCell.2014 Sep 8；30（5）∶541-52.

[2]Ahsan A,Han G,Pan J,Tang Z.Phosphocreatine protects endothelial cells from oxidized lowdensity lipoprotein induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway.Apoptosis[J]. 2015 Dec；20（12）∶1563-76.

[3]胡奇婵，陈玥，王丽，等.腺病毒载体用于基因治疗的研究进展[J].解放军医药杂志，2011，5∶76-80.

[4]Pang P,Wu C,Gong F,Zhu K,Meng X.Nanovector for Gene Transfection and MR Imaging of Mesenchymal Stem Cells.Biomed Nanotechnol[J].2015 Apr；11（4）∶644-56.

[5]Su CH，Wu YJ，Wang HH，Yeh HI.Nonviral gene therapy targeting cardiovascular system[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303（6）：H629-H638.

[6]ChailertvanitkulVA，PoutonCW.Adenovirus∶ablueprintfor non-viral gene delivery[J].Curr Opin Biotechnol，2010，21（5）：627-632.

[7]李爱玲.腺病毒载体在基因治疗研究中的应用[J].陕西农业科学，2012，5∶103-104.

Experimental reserch of human umbilical vein endothelial cells transfected by adenovirus and liposome

Li biao Lan jing Xiao ming（The first people's hospital of neijiang，department of stomatology，Sichuan Neijiang，641000）

Objective∶To discuss the ideal conditions for transfection of human umbilical vein endothelial cells by adenovirus and Liposomes.Method∶Transfection VEGF165 gene into human umbilical vein endothelial cells by using adenovirus vector and Lipofectamine 2000.After transfection，the transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope to explore the ideal way of transfection umbilical vein endothelial cells.Result∶By liposome transfection of human umbilical vein endothelial cells is not satisfactory as the expression was measured rate of about 11.6％.The transfection efficiency of adenovirus vector was significantly higher than that of liposome，and increased with the increase of the number of infection.Conclusion∶The transfection efficiency of human umbilical vein endothelial cells transfected with adenovirus vector was higher than that of liposome method，and when M0I=50 can be used as a safe and effective transfection，which provides experimental basis for the research of human umbilical vein endothelial cells.

Human umbilical vein endothelial cells Cell transfection Adenovirus vector Lipofection

R 543

B

1672-8351（2016）11-0130-02