UPLC测定紫金龙中8-deacetyl-yunaconitine的含量

董永喜，王　霞，孙　绪，李勇军，廖尚高，董　莉

1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004

UPLC测定紫金龙中8-deacetyl-yunaconitine的含量

董永喜1，2，王霞1，2，孙绪1，2，李勇军1，2，廖尚高1，2，董莉1，2

1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004

目的建立紫金龙药材中8-deacetyl-yunaconitine的含量测定方法，为其质量标准的建立提供科学依据。方法于2015年1—6月，选择贵州不同产地紫金龙药材21批，采用超高液相色谱（UPLC）的方法，色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18柱，流动相为乙腈-0.1%醋酸铵，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。记录8-deacetyl-yunaconitine的色谱峰面积。结果测定了21批不同产地的紫金龙药材，8-deacetyl-yunaconitine含量在0.054%～0.250%。平均回收率为99.6%，RSD为0.6%。结论该方法简便、快速、准确、重复性好，可以控制该药材的质量。

紫金龙；8-deacetyl-yunaconitine；UPLC；质量控制

紫金龙为毛茛科植物深裂黄草乌Aconitum vilmorinianum Kom var.altifidum W.T.Wang的干燥块根，收载于《贵州省中药材、民族药质量标准》2003年版［1-2］。具有驱风除湿，温经止痛的功效。已收入国家药品标准的以紫金龙为主药的风湿跌打酊，临床用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、扭伤挫伤引起的腰腿、关节、筋肌疼痛等症时疗效显著，受到广大医生和患者的欢迎。对紫金龙药材的报道，仅有张嘉岷、Xiong J等［3-4］对紫金龙进行分离纯化得到二萜类生物碱。该课题组之前对其，但是目前未见关于紫金莲药材质量控制的研究报道及相关标准。该课题组前期已从紫金龙醇提物进行了抗炎作用及其机制研究［5-6］，并从中分离纯化得到了黄草乌碱丁、hemsleyaconitine G、hemsleyaconitine F等8个生物碱成分［7］，并从中分离得到含量较高的8-deacetyl-yunaconi-tine。该实验自2015年1—6月，选用来自于贵州不同产地的21批紫金龙药材进行8-deacetyl-yunaconitine的含量测定方法研究，为控制和评价紫金龙的质量提供科学依据，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

实验开始于2015年1-6月；21批紫金龙药材，分别采收至贵州，经贵州医科大学生药教研室龙庆德教授鉴定为毛茛科植物深裂黄草乌Aconitum vilmorinianum Kom var.altifidum W.T.Wang的干燥块根；8-deacetylyunaconitine对照品由贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室制备，批号20140516，经1 H-NMR，13 CNMR，MS，UV，IR等波谱鉴定，采用UPLC-DAD在多个波长检测其峰面积归一化结果均大于98.0%；乙腈（色谱纯，批号AS1122-001）；醋酸铵（批号20131006）；纯净水（批号20140722）。

1.2仪器

Thermo UltiMate 3000超高效液相色谱仪（UPLC）系列（包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Chromeleon6.8工作站），TCQ-250超声波清洗器，TGL-16G高速离心机，1/10万电子天平（AE240），超纯水机。

1.3方法

1.3.1色谱条件色谱柱Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm，安捷伦），流动相:乙腈（A）-0.1%醋酸铵（B），流速1.0 mL/min，梯度洗脱（0～5 min，5%～10% A；5～20 min，10%～60%A；20～30 min，60%～95%A；31～36 min，95%～5%A），柱温40℃，检测波长254nm，进样量5 μL。理论板数按8-deacetyl-yunaconitine峰计算应不低于5 000，药材样品中8-deacetyl-yunaconitine与相邻峰达到较好分离，见图1。

图1　紫金龙药材和8-deacetyl-yunaconitine对照品色谱图

1.3.2供试品溶液的配制取紫金龙粉末约3.0 g，精密称定，精密加入30%甲醇溶液30 mL，回流提取2 h放冷，补重，摇匀，滤过。精密吸取续滤液20 mL过聚酰胺柱，用95%乙醇60 mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，20%甲醇复溶并定容至5 mL，离心即得。

1.3.3对照品溶液的配制精密称取对8-deacetyl-yunaconitine对照品6.0 mg置10 mL量瓶中，20%甲醇溶液定容至刻度，得对照品储备溶液。

2　结果

2.1线性关系考察

分别精密量取对照品储备溶液0.15、0.4、1、1.6、2 mL置10 mL量瓶中，20%甲醇溶液定容，摇匀。5 μL进样，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制工作曲线，得回归方程Y=1708.1X+0.523，r=0.9999。结果显示8-deacetyl-yunaconitine进样量在0.045～0.60μg线性关系良好。

2.2精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样6次，结果表明，RSD为0.2%，证明仪器精密度良好。

2.3重复性试验

取同一批号紫金龙药材样品6份，按1.3.2项下方法制备供试品溶液，测定、计算8-deacetyl-yunaconitine的含量及RSD。结果表明，RSD为0.4%，证明重复性良好。

2.4稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h分别进样，结果表明，RSD为2.0%，证明供试品溶液在12 h稳定。

2.5回收率试验

取已测定含量的紫金龙药材6份，每份约1.5g，精密称定，精密加入8-deacetyl-yunaconitine对照品适量，按1.3.2项下方法制备供试品溶液，测定。结果表明，平均回收率为99.6%，RSD为0.6%。证明该方法的回收率良好。

2.6样品测定

取贵州不同产地紫金龙药材按2.1项下方法制备供试液，同时制备对照液，分别进样，记录色谱图，计算药材含量，结果见表1。

3　讨论

紫金龙药材具有驱风除湿，温经止痛的功效。用于跌扑损伤、腰膝疼痛、疮毒等的治疗，为贵州常用的民族药材之一。仅有张嘉岷、Xiong J等［3-4］对紫金龙进行分离纯化得到二萜类生物碱。目前未见关于紫金莲药材质量控制的研究报道，在2003年版《贵州省中药材、民族药质量标准》中，紫金龙药材也仅有性状及鉴别项目，无含量测定项目来控制该药材质量标准。中药组成复杂，产生药效的不是某单一成分，检测任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效。但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药材的有效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于控制中药质量起着不可替代的重要作用［8］。通过测定中药中某些指标性成分的含量来衡量中药材的质量优劣和其制剂工艺的稳定性，以保证中药的质量达到临床用药安全有效的目的。前期研究中发现，紫金龙药材中8-deacetyl-yunaconitine含量较高，且在已分离得到的单体化合物中抗炎活性较好，因此选择其为指标性成分，建立基于此种成分的含量测定方法。

该实验开始前期，首先我们分别考察了三种色谱柱Gemini C18（250 mm×4.6 mm×5 μm，菲罗门），Cortecs C18（100 mm×4.6 mm×2.7 μm，沃特世）和Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm，安捷伦）的分离效果，最终选用了色谱峰分布、峰形、分离度均较好的Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱。以选定的色谱条件，利用UPLC-DAD检测器测定8-deacetyl-yunaconitine的紫外最大吸收峰为207 nm和260 nm。对照品检测灵敏度较高，药材供试品色谱中基本能兼顾各成分色谱峰的丰度、分离度和基线等，故选择254 nm为药材含量测定波长。在供试品溶液制备中分别考察了不同提取溶剂（甲醇、30%甲醇、60%甲醇、乙醇、30%乙醇、60%乙醇）、不同提取方法（回流提取法、超声提取法）对紫金龙药材含量测定的影响。结果表明30%甲醇回流提取2h较好。考虑到酚酸类物质对样品测定的影响，故采用聚酰胺柱对样品提取液进一步纯化。

该实验对贵州产21批紫金龙药材进行了含量测定研究，结果表明，不同产地药材含量差别较大，以贵州水城产紫金龙药材含量较高，最高者达0.250%，可能与生长期、采收季节、气候、土壤等因素有关。该实验所建立的研究方法全面提升了现有紫金龙药材质量控制水平，为充分利用贵州省丰富的苗药资源及其进一步深度开发打下坚实的基础。

表1　不同产地紫金龙药材含量测定结果

［1］贵州省药品监督管理局编.贵州省中药材、民族药材质量标准（2003年版）［M］.贵阳：贵州科技出版社，2003：366.

［2］江毅，李朝斗，杨卫平，等．草药彩色图集［M］．贵阳：贵州科学技术出版社，2001：324.

［3］张嘉崛，吴凤愕，陈耀祖，等.深裂黄草乌二萜类生物碱的研究［J］.植物学报，1997，39（6）：582-584.

［4］Xiong J，Tan N H，Ji C J，et al.Vilmoraconitine，a novel skeleton C19-diterpenoid alkaloid from Aconitum vilmorinianum［J］.Tetrahedron Letters，2008，49（33）：4851-4853.

［5］张晓红，董莉，杨雅欣，等.紫金龙乙醇组分对脂多糖诱导的RAW 264.7细胞分泌炎症因子的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（21）：149-152.

［6］董永喜，王霞，张晓红，等.紫金龙氯仿-甲醇组分对急性实验性炎症的作用及机制研究［J］.中外医疗，2016，35（15）：161-163.

［7］杨雅欣，刘俊宏，李勇军，等.紫金龙低极性部位的生物碱成分研究［J］.天然产物研究与开发，2015，27（4）：613-616.

［8］李波，朴晋华.中药生物活性质量控制的思考［J］.中国药品标准，2012，13（1）：5-8.

Determination of 8-Deacetyl-Yunaconitine in Aconitum Vilmorinianum Kom by Ultra Performance Liquid Chromatography

DONG Yong-xi1，2，WANG Xia1，2，SUN Xu1，2，LI Yong-jun1，2，LIAO Shang-gao1，2，DONG Li1，2
1.Department of Pharmacy，GuiZhou Medical University，Guiyang，Guizhou Province，550025 China；2.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，GuiZhou Medical University，Guiyang，Guizhou Province，550004 China

Objective To develop an UPLC method for determination of 8-deacetyl-yunaconitine in Aconitum vilmorinianum Kom.Methods 21 samples of Aconitum vilmorinianum Kom from January to June 2015 in diffrent palces were selected.Analysis was carried out on a Agilent Eclipse XDB-C18 analytical column，and eluted with a gradient solvent system of acetonitrile-0.1%ammonium acetate as the mobile phaser.The detection wave length was set at 254 nm.The chromatographic peak area of 8-deacetyl-yunaconitine was recorded.Results The contents of in 21samples of Aconitum vilmorinianum Kom were in the ranges of 0.054%～0.250%.The average recovery rate was 99.6%，RSD Was 0.6%.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，and is suitable for the quality control of Aconitum vilmorinianum Kom.

Aconitum vilmorinianum Kom；8-deacetyl-yunaconitine；UPLC；Quality control

R4

A

1674-0742（2016）09（b）－0110-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.26.110

贵州省中药现代化项目（黔科合中药字［2011］5028号）；贵州省科技计划课题任务书黔科合LG字［2012］017号；贵州省高等学校创新能力提升计划（黔教合协同创新字［2013］04）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合重G字［2013］4001）。

董永喜（1983.3-），男，甘肃天水人，硕士，讲师，研究方向：心血管药物设计与合成研究.

董莉（1985.12-），女，四川广安人，硕士，副教授，研究方向：中药药效学、药理学研究和安全性评价，E-mail：108405755@qq.com。

（2016-06-17）