高效液相色谱法同时测定干菊花中五种防腐剂

周斌 杨怀燕 张秀梅 等

摘要：建立了同时测定干菊花中5种防腐剂的高效液相色谱分析方法，优化后的色谱条件为采用Waters XTerra C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）分离，流动相为乙酸水溶液（0.1%）/甲醇梯度洗脱，用二极管阵列检测器在波长254 nm处进行检测。结果表明，5种防腐剂在18 min内可获得较好的分离效果，在0.1～20.0 mg/L范围内线性关系良好（r≥0.999 8），检出限为0.001 5～0.059 0 mg/L，定量限为0.005 0～0.196 8 mg/L，加标回收率为85.9%～97.8%，RSD为0.5%～12.5%。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好，可用于检测干菊花中防腐剂。

关键词：高效液相色谱；防腐剂；干菊花；同时测定

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-1013-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.049

Simultaneous Determination of Five Kinds of Preservatives

in Dried Chrysanthemum Using HPLC

ZHOU Bin1，YANG Huai-yan1，ZHANG Xiu-mei1，CHEN Pin-yan1，LUO Xing-hua1，YANG Jia-qin2，YANG Zhi-min1

（1.Center of Test and Analysis， Institute of Soil Fertilizer and Agricultural Environment， Dali Prefecture Academy of Agricultural Sciences， Dali 671005， Yunnan，China； 2. Dali Town Service Center of Comprehensive Agricultural， Dali 671000， Yunnan， China）

Abstract： High performance liquid chromatography method was developed for the determination of five kinds of preservatives in dried chrysanthemum. The analysis were separated by a Waters XTerra C18 column（3.9 mm×150 mm，5 μm） using 0.1% of ethanoic acid and methanol as mobile phases for gradient elution.A diode array detector was used to detect at 254 nm. The results indicated that five kinds of preservatives were well separated within 18 min， linear relationship were good in the range of 0.1～20.0 mg/L （r≥0.999 8）， the values of detection limit and quantification limit were the range of 0.001 5～0.059 0 mg/L and 0.005 0～0.196 8 mg/L respectively，the recoveries at spiked levels range from 85.9% to 97.8%，the relative standard deviations（RSD） range from 0.5% to 12.5%. With the advantages of simplicity， sensitivity and repeatability， the method could meet the requirements for determination of preservatives in dried chrysanthemum.

Key words： HPLC； preservatives； dried chrysanthemum； simultaneous determination

随着防腐剂技术的发展和提高，复合防腐剂越来越受到人们的重视。复合防腐剂是由几种具有协同效应的防腐剂复配而成，可以克服单一防腐剂在防腐效力上的局限性，扩大抑菌范围和效力，从而降低食品添加剂的用量，提高食用安全性[1，2]，其中山梨酸、对羟基苯甲酸酯类是目前工业中应用最广泛的防腐剂[3]。但过量或非法的防腐剂在一定程度上危害人体健康，甚至威胁人类生命[4]。因此，防腐剂的安全性及检测方法已成为焦点，各个国家的研究者都在努力寻求有效便捷的防腐剂检测方法[5，6]。

菊花是别样茶中的一个古老的品种，可以药用，也可以食用[7]，其有很广泛的生物活性，如抗炎、抗人类免疫缺陷病毒、抗氧化、保护心血管、抗癌、抗突变等[8-10]。随着对外贸易的扩大，中国药品出口量逐年增加，为保证其质量，巩固和扩大国外市场，防腐剂含量的测定已成为重点之一。《中华人民共和国药典》中规定，药品中防腐剂山梨酸含量不得超过0.3%，对羟基苯甲酸酯类（p-hydroxybenzoate）不得超过0.05%[11]。目前，测定防腐剂的方法主要有液相色谱法[6，12]、气相色谱法[13-15]、毛细管电泳法[16]等，可测定干菊花中的防腐剂未见报道。本研究选用在酸性条件下用乙醚提取，经萃取净化，通过液相色谱法进行测试分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪（G1315C-DAD；G1322A-Degasser；G1311A-Quat Pump；G1367C-Hip ALS SL；G1316B-TCC SL），Waters XTerra C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；山梨酸、对羟基苯甲酸（甲、乙、丙、丁）酯标准品（纯度≥99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH），甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），其他试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.2 样品准备与处理

样品经粉碎机粉碎，称取0.5 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL 1%乙酸乙醚摇匀，进行超声提取5 min，4 000 r/min离心5 min，将上清液转入旋蒸瓶中，提取重复3次合并。旋蒸瓶中的提取液经旋蒸仪（40 ℃）蒸干，用1%乙酸乙醚溶解移入比色管中，水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）的萃取体系萃取3次，合并1%乙酸乙醚部分萃取液蒸干，最后用1%乙酸甲醇溶解移入容量瓶中定容至10 mL，经0.45 μm微孔过滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

1.3 色谱条件

Waters XTerra C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇和0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，40 %甲醇；5～15 min，40%～60%甲醇；15～30 min，60%～80%甲醇。流速：0.8 mL/min；柱温：35 ℃；检测器：DAD；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

用二极管阵列检测器在210～400 nm范围内对各组分的标准溶液进行光谱扫描。结果表明，5个组分中有4个组分在256.8 nm处具有较高的灵敏度，而另1个组分在230 nm处具有较高的灵敏度，为综合考虑检测灵敏度，选择254 nm作为检测波长。

2.2 色谱条件的选择

在参照文献[17]选择甲醇和0.1%乙酸水溶液为流动相，因此，对梯度洗脱程序进行优化，参照“1.3”色谱条件，5种防腐剂得到有效分离，且灵敏度较高。5种防腐剂混合标准溶液的色谱图见图1。2.3 提取溶剂和萃取体系的选择

山梨酸、对羟基苯甲酸酯微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙醚等溶剂。分别选用甲醇、乙腈和乙醚提取溶剂进行提取比较，发现甲醇和乙腈提取液的颜色要比乙醚提取液的颜色要深，且通过HPLC检测甲醇和乙腈提取物对检测目标物干扰突出，乙醚提取物对检测目标物干扰很小。考虑到尽可能减小干扰和提高回收率，选择在酸性条件下提取和萃取，结果发现用1%乙酸乙醚提取，并用水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）的萃取体系萃取时，回收率可达95%以上。因此，选择1%乙酸乙醚为提取溶剂、水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）为萃取体系。

2.4 方法的评价

2.4.1 標准曲线的线性范围 在确定的色谱条件下对质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/L的混合标准溶液分别进行测定，以各组分的峰面积（Y）对其质量浓度（X，mg/L）进行线性回归。结果表明，山梨酸和4种对羟基苯甲酸酯类化合物在0.1～20.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 8，回归方程见表1。

2.4.2 检出限和定量限 根据仪器检出限限量的要求，连续测定最低浓度标准溶液20次，求出相对偏差（SA），工作曲线的斜率为灵敏度（S）。3SA/S为检出限，10SA/S为定量限，结果见表2。

2.4.3 准确度和精密度 将配置好的混合标准溶液按“1.3”色谱条件，对3个浓度连续测定6次，按峰面积计算。RSD均在2.49%以下，结果表明仪器精密度良好，测定结果见表3。

2.4.4 加标回收率试验 以未加防腐剂的样品为空白，分别加入两个不同浓度水平的防腐剂混合标准溶液适量，进行加标回收试验，回收率结果见表4。回收率在85.9%～97.8%，RSD在0.5%～12.5%，具有理想的回收率。

3 结论

结果表明，使用高效液相色谱法对干菊花中山梨酸、4种对羟基苯甲酸酯同时检测，样品加标回收率在85.9%～97.8%之间，线性系数r≥0.999 8，检出限为0.001 5～0.059 0 mg/L，定量限为0.005 0～0.196 8 mg/L，能够满足样品中防腐剂残留量的分析要求。

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