葛属植物基于形态学和rDNA ITS分类的一致性比较研究

蒋向辉 刘良科 佘朝文

摘要：试验以来自不同地区的葛属（Pueraria DC）植物11个种质作为材料，基于其叶色、茎粗、茎节长、茎色、茎粗、茎被毛等9个形态性状进行形态学分类，并对11个种质的rDNA ITS序列进行克隆测序和序列比较分析，采用MEGA 6.0软件构建ITS序列系统进化树。结果表明，基于ITS序列和基于形态特征的分类结果虽有一定的相似性，但仍存在较大的差异。不同分类方法导致的结果差异可能与形态特征受其生长条件、性状的选取等多方面因素的影响有关，而基于rDNA ITS序列的分类结果更为可靠。

关键词：葛属（Pueraria DC）；形态学；rDNA；ITS序列；分类一致性

中图分类号：Q949 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0939-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.032

Study on Classification Consistency Based on Morphology and rDNA ITS

Sequences of Pueraria Species

JIANG Xiang-hui1，LIU Liang-ke2，SHE Chao-wen2

（1. College of Chemistry and Materials Engineering， Kaili University， Kaili 556011， Guizhou， China；

2. Department of Life Science， Huaihua University， Huaihua 418008， Hunan， China）

Abstract： 11 germplasms of Pueraria DC from different regions were classifed by morphological classification method based on 9 morphological characters including leaf color， stem thickness， internodes length， stem color， stem diameter， stem hair； meanwhile， cluster analysis was conducted by MEGA 6.0 software based on rDNA ITS sequences of the 11 Pueraria species. It was found that the result of cluster analysis and morphological classification method had some similarities while the differences were obvious. The research suggested that the differences between different classification methods might be related to the morphological traits which could be affected by growth conditions， as well as the character selected； thus the classification result based on rDNA ITS was more reliable.

Key words：Pueraria DC； morphology； rDNA； ITS sequences； classification consistency

葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]又叫葛藤，为豆科（Leguminosae）葛属（Pueraria DC.）植物[1]。葛属植物全世界约有20种[2]，我国主要种类有野葛、甘葛藤、娥眉葛、食用葛、粉藤、云南葛、丽花葛等，其中野葛、粉藤分布最广、产量也较高，是我国资源最多的2个种[3]。不同来源的葛无论是形态结构还是活性成分都有差异，即使是同一种葛在不同的生长条件下各方面也会产生差异。陶娟等[4]对葛属植物活性成分研究后发现，不同来源的葛其活性成分含量高低呈现由北向南逐渐递减的趋势，同种葛的活性成分含量也是表现为北方的相对较高、南方的相对较低。葛茎是我国湖南、湖北、贵州、江西等省的常见蔬菜，葛根富含葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮、大豆黄酮甙及β-谷甾醇、花生酸等多种活性成分，还含有大量的淀粉，葛根有解表退热、生津止渴、止泻的功能，并能改善高血压与糖尿病患者头晕、头痛的症状[5]。葛根毒性低、药源广、价格低，对葛根开发新药和保健品具有良好的发展前景。

物种遗传多样性是物种进化的基础，物种遗传多样性研究最初主要集中在形态特征方面的描述、鉴别与分类，迄今为止，形态性状的共性与差异仍是植物分类的主要依据。形态性状标记主要分为2类：单基因决定的质量性状与多基因决定的数量性状。基于形态标记的遗传多样性具有简便、快速、花费少等优点，但其不足是这些性状的遗传机制较为复杂，遗传率低，且环境条件对其影响较大，导致观测标准不一致，标记同源性难以把握，不能完全满足遗传多样性分析的需要。20世紀80年代以来，随着分子生物学和分子克隆技术的发展，一系列基于DNA序列变异的遗传多样性检测方法应运而生[6]，研究表明，ITS序列与其保守性序列相比，其变异相对较快，信息位点和变异位点较为丰富，将其用于被子植物进化与类群分析，可以有效区分科、亚科、族、属之间的系统发育关系[7]。鉴于此，试验对葛属的11个种质以形态学为基础进行初步分类的同时，根据它们的rDNA ITS序列特征进行比较分析，构建了系统发育树，试图将形态标记与DNA分子标记结合起来对葛属物种进行遗传多样性分析，以期为葛属物种的分类鉴定与亲缘关系分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料为葛属11个不同来源的种质，相关信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 形态学分析 对不同来源的葛属种质进行形态学描述，筛选出物种间既有共性、又有差异的9个形态学性状叶色、叶大小、茎粗细、茎节长短、节间膨大、茎颜色、芽粗细、茎被毛密度、茎被毛颜色；参照郭先锋等[8]的方法对性状进行赋值处理，采用MEGA 6.0软件对11份种质进行聚类分析，并绘制树状图。

1.2.2 ITS序列克隆与序列分析 采用CTAB法提取供试物种基因组DNA。用于扩增的ITS序列引物参照White等[9]设计的ITS通用引物，其序列的上游引物为ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，下游引物为ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，36个循环；最后72 ℃延伸5 min。采用长沙安比奥生物试剂有限公司的DNA回收试剂盒进行PCR产物回收，继而将回收产物与pMD18-T质粒在16 ℃下连接12 h，获得重组质粒后转化至大肠杆菌（Escherichia coil）菌株DH5α中，菌株来自湖南大学生物学院。在获得重组菌斑后，采用长沙安比奥生物试剂有限公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒，进一步经双酶切鉴定后，将质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测得序列经NCBI网站比对确认后，将序列在Gen Bank上登錄，获得登录号。以NCB网站提供的甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]ITS序列为外类群，采用MEGA 6.0软件对11份种质进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 植物学性状比较

供试葛属种质的9个形态学性状比较情况见表2，叶片形态学比较情况见图1。从表2可见，11个不同来源的种质其茎杆都比较粗壮，颜色主要有绿色、黄绿色和淡绿色。从图1可见，11个种质叶上被毛疏密各不相同，颜色以白色、黄褐色和淡绿色为主；叶片互生，叶型主要为卵圆型，叶片颜色以绿色、淡黄色和黄绿色为主；小叶主要有三裂、两裂2种类型，下裂深浅差异较明显。其中，广东合水粉葛叶色黄绿，被茸毛少且短，三出复叶，小叶全缘；湖南常德粉葛叶黄褐色，叶片较细且窄，三出复叶，小叶多三裂且较深，叶柄较长，叶尖端较长且均匀；广西藤县粉葛叶片绿色，被白色茸毛，但较少，三出复叶，小叶多三裂且裂浅；重庆合川粉葛叶淡绿色，三出复叶，叶缘三裂，叶片宽大肥厚，叶背面有少量绿茸毛；云南蒙自粉葛叶绿色微泛黄，叶大而肥厚，小叶两裂，叶尖，叶柄细长，基部膨大明显；江西德兴超级粉葛叶大呈盾形，绿色，不带齿，叶面少毛，叶柄长；湖南大卫粉葛叶黄绿色，叶片较宽大，三出复叶，小叶全缘，被黄褐色茸毛，叶柄较长，叶脉明显；湖南通道山葛叶极具特色，卵圆形，浓绿色，三出复叶，很少下裂，被毛少；重庆武隆苦葛羽状复叶，具3小叶，小叶斜卵形，三裂，且裂深；湖南会同山葛叶卵圆形，淡绿色，叶柄粗短，被毛少，叶脉明显；湖南常宁野葛叶淡绿色，宽大，被毛少，三出复叶，小叶有时两裂，有时三裂，叶脉明显，主脉粗。由此可见，葛属不同种质的叶片形态差异明显。

2.2 植物学性状聚类分析

供试葛属11个种质基于植物形态学的MP聚类图见图2。从图2可以看出，11个葛属材料之间遗传距离相距较远，以相对遗传距离15为界，可将11个种质分为4个组，分别与以上不同的形态类型相对应，如湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川粉葛、重庆武隆苦葛、湖南常宁野葛可聚为一组，其中有3种属于粉葛，其性状表现变化不是很大；广东合水粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛可聚为一组，湖南通道山葛、湖南会同山葛都属于山葛，且都来源于湖南省，由于在同一小范围地区内受气候环境影响变化不大，导致遗传性状变化很小，所以性状极其相似；云南蒙自粉葛、江西德兴超级粉葛、湖南大卫粉葛都各为一组，可能是由于来源不同的地域，地理间隔较远，气候温差、土壤成分、日照长短差异较大影响了粉葛的植物学性状所致。

2.3 葛属11个种质基于rDNA ITS序列的亲缘关系分析

基于rDNA ITS序列构建的葛属植物MP系统发育树见图3。从图3可以看出，湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川粉葛、云南蒙自粉葛、重庆武隆苦葛聚在了一起，亲缘关系较近，可归为一类。湖南常宁野葛、江西德兴超级粉葛聚在了一起，亲缘关系最近，可归为第二类。广东合水粉葛、湖南大卫粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛与其他葛相距较远，可各自成为一类。

2.4 形态学和rDNA ITS分类的一致性比较研究

从形态学和rDNA ITS分类的比较分析可以看出，湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川粉葛、重庆武隆苦葛在2种方法中都能聚为一组，并且前3种都属于粉葛，其性状变化不是很大，重庆武隆苦葛与粉葛不仅形态相近，且在遗传上差异较小，2个种之间亲缘关系相近。湖南常宁野葛与江西德兴超级粉葛在遗传上有一定的相似性，但形态上差异较大，可能与生长环境的生态因素有一定的关系。总的来说，基于分子水平上的分类结果与基于形态学性状的分类结果之间有较大的相似性，但也存在一定的差异，这种差异可能与性状受环境与基因2个因素共同的影响有关。不过基于形态学性状的聚类结果受环境的影响较大，而采用分子水平的分类是以能够稳定遗传的DNA序列为基础，因此分子水平聚类结果比形态学结果更可信。

3 小结与讨论

依据形态学特征对葛的分类鉴定不仅与葛的生长时期、生长环境等客观因素有关，而且形态学性状的判断和选取受主观因素的影响很大，因此基于形态学性状特征对葛进行分类分析和鉴定存在很大的局限性，尤其是对于某些形态学特征极为不明显或相近的葛，就很难准确的进行分类。有学者在研究基于形态学和分子生物学分类比较时发现，在形态上相似的情况下，内部结构也有较大的区别，如杨祝良[10]对我国部分鹅膏菌标本与欧美相似种的标本进行比较研究后，发现二者虽在外部形态上有相似之处，但在内部结构上存在较大差异，并且在分子生物学方面也同样存在较大的差异。

本试验结果也表明，基于传统形态特征的分类与基于rDNA的ITS序列分类结果有很大的差异。如基于ITS序列构建的葛属11个种质的MP系统发育树表明，湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川粉葛、云南蒙自粉葛、重庆武隆苦葛亲缘关系较近；而根据葛属的11个种质形态学聚类图，它们中的云南蒙自粉葛关系比较远。另外，从基于ITS序列构建的葛属植物MP系统发育树可知，广东合水粉葛、湖南大卫粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛与其他葛相距较远，且相互之间也存在很大差异；而根据形态学的MP聚类图，广东合水粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛可聚为为一组；这说明形态学性状的选取有待于改进，应更全面、更准确地选取性状。在不具备分子生物学相关条件的情况下，对植物的分类鉴别主要是借助植物学形态特征之间的共性与差异来区分，而形态学特征具有易变、模糊和易混淆等多方面的缺陷，在分类过程中常带有一定的主观性和局限性。现在以rDNA的ITS序列为基础的分类与鉴别研究越来越多，如基于形态特征和ITS序列對7个鹅膏菌属菌株的分类鉴定[11]、rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用[7]、ITS序列鉴定西红花与其易混的中药材[12]、基于ITS序列的东亚当归属植物的分类学研究[13]等等；上述研究表明，基于分子生物学层面的分类更科学、更可靠，虽然还有许多需要完善的地方，但这是物种分类发展的主要方向。

参考文献：

[1] 周精华，揭雨成，杜晓华，等.葛种质资源亲缘关系的RAPD分析[J].作物研究，2013，27（4）：347-350.

[2] 蒋永福，张 焜，方岩雄，等.葛的研究与应用进展[J].广州化工，2002，30（4）：31-34.

[3] 张鹤山，刘 洋.葛资源利用现状及发展前景[J].安徽农学通报，2008，14（5）：69-89.

[4] 陶 娟，许慕农，路秋生，等.中国葛属植物资源和利用情况[J].中国野生植物资源，2007，26（3）：38-41.

[5] 李天星，李新民.中药葛根的研究进展[J].湖南中医杂志，2013，29（8）：151-153.

[6] 邹学校.辣椒主要数量性状遗传与雄性不育相关机理的研究[D].南京：南京农业大学，2005.

[7] 王建波，张文驹，陈家宽，等.核rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用[J].植物分类学报，1999，37（4）：407-416.

[8] 郭先锋，王莲英.我国栽培芍药与几个近缘种的数量分类学研究[J]. 园艺学报， 2005， 32（3）： 473-476.

[9] WHITE T J，BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]. INNES M， GELFAND D， SNINSKY J， et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press，1990. 315-322.

[10] 杨祝良.试谈我国鹅膏菌的分类研究[J].菌物系统，2000， 19（3）：435-440.

[11] 李海波，吴学谦，魏海龙，等.基于形态特征和ITS序列对7个鹅膏菌属菌株的分类鉴定[J].菌物研究，2007，26（1）：15-19.

[12] 车 建，唐 琳，刘 彦，等.ITS序列鉴定西红花与其易混中药材[J].中国中药杂志，2007，32（8）：668-671.

[13] 薛华杰，闫茂华，陆长梅，等.基于ITS序列的东亚当归属植物的分类学研究[J].植物分类学报，2007，45（6）：783-795.