利用特异性SNP位点鉴定花生杂交F1代真假杂种

韩燕　马登超　刘译阳　崔凤　孙秀芹　李荣冲　万书波　李国卫

摘要：以鲁花14、Tifrunner和四粒红为亲本通过正、反交获得的杂种F₁代群体为材料，结合亲本间特异性单核苷酸多态性（single Nucleotide Polymorphism，SNP）位点，建立起一套利用限制性内切酶酶切方法鉴定花生杂交F₁，代真假杂种的技术。结果表明，真杂种表现出父、母本带型，而假杂种只表现出母本带型；4个组合中F₁代真杂种率为10.5%～36.7%。因此，该技术能够有效应用于花生杂交F₁代的真假杂种鉴定。

关键词：花生；SNP；杂种鉴定；限制性内切酶

中图分类号：S565.2+Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0014-04

花生（Arachis hypogaea L.）也称作长生果，是我国重要的农作物之一，具有较高的经济和营养价值。通过杂交育种将优良基因导入栽培花生是花生栽培种改良的主要手段。但是，目前有关花生真假杂种鉴别的途径较为繁琐，形态表型观察仍是花生杂种真伪鉴别的主要方法。然而由于花生品种间遗传基础狭窄，形态表型差异较小，通过形态表型鉴别真假杂种难度较大，并且有较多的假阳性。在基因组序列未知的条件下，利用人们已开发出的多种分子标记如SSR、Ah-MITE1等，对杂种后代进行鉴定，得到了广泛地应用。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polynor-phisms，SNP）是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP在基因组位点上呈现为单个核苷酸的变化，多发生在T和C之间。SNP在技术上有着较大的比较优势，它能够稳定地存在于生物体的整个基因组中，突变率低，在遗传上常呈现惰性和显性；此外，SNP能够分辨等位基因上的差异，简单地对基因进行分型，从而摆脱了电泳分型的瓶颈。在此基础上，SNP成为继RFLP和SSR后发展起来的第三代遗传标记，被广泛运用在动植物性状的关联性研究中。在花生中，Zhou等利用简化基因组测序技术发现的SNP位点，构建了花生基于高密度SNP的遗传图谱。Chopra等利用下一代转录组测序技术鉴定了市场上四类花生品种的SNP，结果显示SNP可被有效用为分子标记来鉴定花生品种资源。

本研究旨在建立一套利用不同花生品种问存在的SNP位点，根据其多态性选取合适的酶切位点，设计开发有效引物，扩增片段，利用上述酶切位点进行酶切验证，根据其片段的多态性来简便、有效地鉴定花生F₁代真假杂种的鉴定技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以早熟直立大花生品种鲁花14、匍匐型品种Tifrunner与四粒红品种及以其作为亲本正反交得到的F₁代群体为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用改良的CTAB法提取花生基因组DNA。取新鲜幼嫩的叶片约0.5g，用液氮研磨成粉状；加入0.5mL65℃预热的CTAB抽提缓冲液（使用前加入2%β-巯基乙醇），充分混合，65℃水浴30min，期间摇动数次，12000r/min离心10min，取上清；加入等体积的酚+氯仿+异戊醇（25：24：1），缓慢颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清；加入等体积的氯仿充分混匀，12000r/min离心10min，取上清；加入等体积的冰冻异丙醇，置于-200℃冰箱中30min；12000r/min离心10min，弃上清液；用800μL70%乙醇漂洗2次，风干；用50μL无菌水溶解DNA，置于-200℃冰箱中备用。

1.2.2 PCR扩增体系及程序 PCR扩增体系（20μL）：正、反向引物（10μmol/L）各0.6μL，10×Buffer2μL，dNTPs（2mmol/L）2μL，MgSO₄（25mmol/L）1.2μL，KOD酶（1U/μL）0.4μL，50ngDNA模板1tμL，ddH₂O12.2μL。

反应程序：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.3 PCR产物检测及回收 将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶在0.5×TBE电泳缓冲液中进行水平电泳，电泳电压130V，时间15min。电泳结束后在凝胶成像仪进行观察并拍照。

在紫外光下对照Marker观察电泳结果，用干净的小刀从胶板上切下目的条带。使用Axygen琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒对目的DNA片段进行回收与纯化，方法详见说明书。

1.2.4 F₁代杂种鉴定 对上述纯化目的DNA片段进行酶切反应（10μL）：胶回收产物5μL、限制性内切酶Hindm0.3μL、10×M Buffer（M Buffer为内切酶对应的Buffer）1μL、ddH₂O 3.7μL。37℃酶切5h。电泳观察酶切片段的位置和大小。

酶切条带表现为父母本杂合带型的F₁代植株为真杂种，仅含有母本条带的为假杂种。

2 结果与分析

2.1 亲本间SNP位点筛选及引物设计

利用对鲁花14、Tifrunner及四粒红高通量测序及SNP分析的结果，从花生基因组中选取一段序列，该段序列中含有特异的SNP位点（图1），该位点在鲁花14与Tifrunner中表现为胞嘧啶（C），而在四粒红中则突变为胸腺嘧啶（T）。该SNP位点前后6个碱基恰好为限制性内切酶HindⅢ所能识别的酶切位点AAGCTT，而在四粒红中则由于突变为T不能被HindⅢ识别。

以此段序列为模板，在其两端设计正向引物TTTGCCAAGAGTACAAGCACA、反向引物CG-CAAGTAGTITCGCAAATG，该引物扩增目的片段大小为755bp。

2.2 DNA质量及产物特异性检测

由于花生叶片中含有较多的次生代谢物及糖类杂质，本试验在CTAB使用前加入2%β-巯基乙醇可有效地防止次生代谢物质使DNA变色，同时在抽提的过程中多使用一次氯仿可以有效去除叶片中的蛋白质，从而得到杂质较少的DNA（图2A）。以此DNA为模板进行扩增，可有效、特异地扩增出目的条带（图2B）。

2.3 F₁代真假杂种鉴定

利用限制性内切酶HindⅢ分别对4个杂交组合的F₁代扩增产物进行酶切鉴定，部分材料的鉴定结果见图3。鲁花14、Tifrunner与四粒红杂交组合的F₁代后代中，由于从鲁花14或Tifrun-ner基因组序列获得的片段具有HindⅢ的识别位点，因而扩增产物能够切出395bp和362bp两条片段，两条片段大小非常相近，故电泳只显示为一条带；而从四粒红基因组获得的片段不具有HindⅢ识别序列，故只有一条755bp的带。因此，真杂种具有父母本的带型，电泳显示为两条带，而假杂种仅表现出母本的带型，电泳显示为一条带。统计并计算各杂交组合的真杂种率（表1），鲁花14与四粒红正、反交组合的真杂种率分别为10.5%与25.9%，低于Tifrunner与四粒红正、反交组合的真杂种率。

3 结论与讨论

目前，花生真假杂种的鉴定往往采用形态学观察结合DNA分子标记技术。DNA分子标记虽然具有多态性高、检测灵敏等优点，然而利用分子标记进行杂种鉴定时，对DNA的质量要求较高，需要开发筛选多对引物，因此鉴定过程较为繁琐，不利于大规模的后代鉴定。本研究采用高通量测序技术及生物信息学分析方法，开发出有效的SNP位点，首次鉴定了四粒红与鲁花14、Tifrunner的杂交后代。该方法既能快速有效、省时省力地鉴定花生基因型及真假杂种，又可为建立花生连锁图谱做准备，具有潜在的应用价值，为高效利用花生种质资源奠定了基础。