水稻α—NAC基因家族的克隆及生物信息学分析

王晓静　孙林静　马忠友　孙玥　李军玲　张融雪　闫双勇　刘学军

摘要：新生多肽结合复合体（Nascent polypeptide-associated complex，NAC）是由d和B两个亚基组成的异二聚体复合物。水稻新生多肽结合复合体α链基因家族共有3个基因，分别位于1、3号和5号染色体上。本研究根据公布的水稻基因组序列，通过RT-PCR方法克隆了粳稻品种中花11号中α-NAC家族的3个基因。经生物信息学分析发现，水稻α-NAC基因家族的氨基酸序列比较保守，包含NAC和UBA两个结构域，与玉米NAC基因家族的亲缘关系最近。OslgNAC和Os3gNAC、Os5gNAC的相似性分别为67.4%、81.8%，Os3gNAC和Os5gNAC的相似性为69.5%。本研究结果为Osα-NAC蛋白纯化及蛋白结构生物学研究提供参考，为今后Osα-NAC基因家族的生物学功能研究奠定基础。

关键词：水稻；新生多肽结合复合体α链；生物信息学分析

中图分类号：S511+Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0008-06

新生多肽结合复合体（Nascent polypeptide-associated complex，NAC）由α链和β链组成，在体内和体外均可以形成一个稳定的有功能的复合体。根据不同物种的同源序列比较发现，NAC有一段非常保守的结构域，称为NAC结构域，一般位于亚基的N端。NAC的两个亚基都可以在核糖体上与新生多肽直接作用，是核糖体输出通道的动力组成部分，给新生多肽的形成提供保护，阻止不合适的蛋白相互作用。在人的造骨细胞中发现α-NAC虽然本身不是一个转录因子，但它可能具有共激活某些转录因子的功能。为了行使转录共激活子功能，α-NAC能够在细胞质和细胞核中穿梭。因此，α-NAC被认为是具有调控转录和翻译双重功能的蛋白。

近年来，植物中对β-NAC的研究报道逐渐增多。从辣椒（Capsicum annuum）中克隆到和β-NAC同源性很高的CaBTF3，其对辣椒的HR抗病机制有作用。与对照辣椒植株相比，受烟草花叶病毒侵染的CaBTF3沉默辣椒植株中，HR导致的坏死细胞数量减少，同时HR相关基因的表达量下降，烟草花叶病毒的外壳蛋白量增加。在拟南芥中过量表达互花米草（Spartina alterniflo-ra）的β-NAC后，在正常生长环境下，转基因植株的生长发育状况不受影响，但是在盐害和干旱胁迫条件下，转基因植株表现出较强的抵抗力。在小麦中，BTF3（β-NAC）沉默的转基因植株不耐干旱和冻害。在水稻中，BTF3（β-NAC）对种子萌发和植株生长发育具有重要的功能，OsBTF3沉默的转基因植株的生长受到明显抑制，花粉活力和种子数量明显减少。有人通过分子克隆的方法从水稻中得到OsBTF3基因，对其表达模式进行分析，并获得了OsBTF3过表达和RNAi转基因水稻，对OsBTF3在抗病性、抗逆性和生长发育过程中的生物学功能进行研究。α-NAC和β-NAC以异源二聚体的形式存在于植物细胞中，推测α-NAC也具有重要的生理功能。虽然α-NAC在植物物种中广泛存在，但其生物学功能的研究尚未见报道。

本研究根据网站http：//rice.plantbiology.mSU.edu公布的水稻基因组序列信息，利用Prim-er Premier 5.0设计特异引物，采用RT-PCR方法从粳稻品种中花11号中分别克隆得到α-NAC家族三个基因的全长cDNA，并通过生物信息学软件对α-NAC基因家族的同源基因进行分析，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粳稻品种中花11号种植于上海市植物生理生态研究所人工气候室。大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存；TRIZOL为Invitrogen公司产品；Rever Tra Aceα为Toyobo公司产品；EX Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker及pMD19-T载体为TaKaRa公司产品；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为上海生工生物工程股份有限公司产品；引物合成和基因测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 Ostr-NAC基因家族的克隆

1.2.1 水稻总RNA的提取及cDNA第一链的合成取水稻三叶期新鲜叶片加液氮研磨至粉末，每50～100mg材料加入1mL TRIZOL（Invitro-gen），振荡混匀，依照说明书进行总RNA提取，电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测定260、280nm下的吸光值，计算总RNA的纯度与浓度。以总RNA为模板，Oligo（dT）为引物，按照Rever TraAce仅（Toyobo）说明书进行反转录。20μL反转录反应体系：5×RT Buffer 4μL，dNTP混合物（各10mmol/L）2μL，RNase抑制剂（10U/μL）1μL，Oligo（dT）₂₀（10pmol/μL）μL，反转录酶1μL，总RNA2～3μg，加Nuclease-free去离子水补足至20μL。反应条件为：42%反应1h。产物保存于-20℃备用。

1.2.2 基因的克隆及测序

根据网站公布的水稻基因组序列信息，利用Primer Premier 5.0设计特异引物（表1），以合成的cDNA第一链为模板进行PCR扩增。反应体系为20μL，反应条件为：94℃10min；94℃30s，56～60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像分析系统下观察并拍照。

按照TaKaRa公司的pMD19-T载体说明书，将切胶回收的目的片段进行连接反应。连接液体系为10μL：连接液5μL，载体0.5μL，回收DNA的量2.5μL，去离子蒸馏水2μL。16℃连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH50t感受态细胞，取细胞悬浮液涂布于含Amp的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落，进行PCR检测。挑选阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 根据水稻基因组注释项目网站（http：//rice.plantbiology.msu.edu）上Osα-NAC基因家族3个基因的相关信息，使用BioEdit和ORFFinder分别分析cDNA的碱基组成和开放阅读框（ORF）。在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上搜集拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、果蝇（Drosoph-ila melanogaster）、古细菌（Methanothermobactermarburgensis）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、线虫（Caenorhabditis elegans）、小鼠（Mus musculus）和人类（Homo sapiens）等物种α-NAC的氨基酸序列，并进行同源性比较。通过MEGA5.1软件将19个α-NAC蛋白进行进化分析，根据邻接法构建进化树。

2 结果与分析

2.1 Osα-NAC基因的序列分析

Osα-NAC基因家族共有3个成员，分别位于1、3号和5号染色体上，根据其在染色体的分布位置分别命名为OslgNAC、Os3gNAC和Os5gNAC。依据水稻基因组注释项目网站的注释及序列分析得知，OslgNAC的全长DNA为2759bp，包含4个外显子和3个内含子，5-UTR长112bp，3-UTR长281bp，蛋白质编码区（CDS）长609bp，预测的编码蛋白有203个氨基酸残基（图1A）。Os3gNAC的全长DNA为2251bp，包含3个外显子和2个内含子，5-UTR长159bp，3-UTR长1090bp，蛋白质编码区长666bp，预测的编码蛋白有222个氨基酸残基（图1B）。Os5gNAC的全长DNA为2119bp，包含4个外显子和3个内含子，5-UTR长81bp，3-UTR长432bp，蛋白质编码区长618bp，预测的编码蛋白有209个氨基酸残基（图1C）。

2.2 Osα-NAC基因的克隆

使用设计的引物分别以水稻全长cDNA为模板进行PCR反应，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，片段大小与预期相符（图2）。将目的片段切胶回收，与pMD19-T载体连接，转化感受态细胞，各挑选2个阳性克隆进行测序，结果与网站公布的序列结果一致。

2.3 α-NAC的氨基酸序列比对分析

2.3.1 不同物种α-NAC氨基酸序列同源性分析人类、线虫、酵母都只含有一个α-NAC基因，水稻和拟南芥在进化过程中分化出多个α-NAC的同源基因。不同物种α-NAC的氨基酸序列比对分析（图3）表明，α-NAC的氨基酸序列比较保守，包含NAC和UBA（Ubiquitin-associ-ated）两个结构域，分别处于肽链的N端和C末端。

2.3.2 水稻和拟南芥α-NAC的氨基酸序列比对分析水稻和拟南芥不同α-NAC蛋白之间的氨基酸序列相似性差别不大，在50%～85%之间（表2），其中AtNACA1和AtNACA3之间的氨基酸序列相似性最高，达到了84.8%，而AtNACA1和AtNACA5之间的相似性最低，为53.6%。在进化树分析中，水稻的Os1gNAC和Os5gNAC亲缘性最近，氨基酸序列比较显示它们的序列相似性达到了81.8%，说明它们可能具有相似的生物学功能。

2.4 α-NAC的系统进化分析

对α-NAC蛋白的进化分析（图4）表明，古细菌α-NAC（aeNAC）单独成为一个分支，之后又进化出酵母（EGD2）和其余物种的仅一NAC蛋白，说明古细菌α-NAC属于α-NAC基因家族出现较早的基因。在另一节点上，可以看到植物α-NAC蛋白和动物α-NAC蛋白在进化上形成两个不同的分支。Os1gNAC和Os5gNAC的亲缘关系比较近，与玉米的3个NAC蛋白（Zm1NAC、Zm2NAC、Zm3NAC）属于同一个分支，而Os3gNAC和它们的亲缘关系则比较远，与玉米的另一个NAC蛋白（zm4NAC）属于同一个分支。

3 结论与讨论

NAC是广泛存在于细菌、动物和植物中的保守蛋白，由α和β两条链组成。不同物种α-NAC含有不同数目的同源基因，植物α-NAC基因家族较庞大。本研究通过RT-PCR方式从水稻中成功克隆得到Osα-NAC基因家族的3个基因，根据其所在染色体的位置，分别命名为Os1gNAC、Os3gNAC和OsggNAC。生物信息学分析结果表明，Osα-NAC基因家族的3个基因全长DNA大小分别为2759、2251bp和2119bp，都包含有外显子和内含子。不同物种的氨基酸同源序列比较发现，α-NAC基因家族的氨基酸序列比较保守，包含NAC和UBA两个结构域，其中位于亚基N端的NAC结构域在α-NAC和β-NAC中均存在，而UBA结构域则只在α-NAC的C端存在。对α-NAC蛋白的进化分析表明，古细菌α-NAC属于α-NAC基因家族出现较早的基因。Os1gNAC与Os5gNAC的亲缘关系比较近，而Os3gNAC与它们的亲缘关系则比较远。

本研究首次报道了Osα-NAC基因家族的3个基因，克隆得到的产物和生物信息学分析数据将对以后的研究工作提供试验材料和科学依据，为水稻抗逆新品种的培育及利用基因工程手段改良水稻提供优良的基因资源。