HPLC法测定抗骨质增生片中淫羊藿苷的含量

张桂林，马慧萍，李兰茹，董志臣，何 蕾，贾正平（兰州军区兰州总医院药材科，兰州 730050）

HPLC法测定抗骨质增生片中淫羊藿苷的含量

张桂林＊，马慧萍#，李兰茹，董志臣，何 蕾，贾正平（兰州军区兰州总医院药材科，兰州 730050）

目的：建立测定抗骨质增生片中淫羊藿苷含量的方法，以期为完善该制剂的质量标准提供依据。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil ODS2 C18，流动相为乙腈-水（27∶73，V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为270 nm，柱温为25℃，进样量为10 μl。结果：淫羊藿苷检测质量浓度线性范围为3～60 μg/ml（r=0.999 9）；定量限为11.2 μg/ml，检测限为4.3 μg/ml；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率为99.00%～100.67%（RSD=0.63%，n=6）。结论：该方法操作简便、结果准确、重复性好，可用于测定抗骨质增生片中淫羊藿苷的含量。

抗骨质增生片；淫羊藿苷；高效液相色谱法；含量测定

抗骨质增生片是兰州军区总医院自制的纯中药制剂［批准文号：兰制字（2012）F00020号］，其是由熟地黄、鸡血藤、肉苁蓉、淫羊藿等多味中药材经提取加工而制成，具有滋补肝肾、强壮筋骨、益精养血、活血通络的作用［1］；临床主要用于治疗骨质增生及骨退行性病变等症。淫羊藿为方中君药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，其主要有效成分是黄酮类化合物淫羊藿苷［2］。现代药理学研究发现，淫羊藿苷具有多种生物活性［3-7］，并有抗缺氧、抗氧化等多种生物学功效［8-10］。由于目前尚未有测定抗骨质增生片中淫羊藿苷含量的报道，因此笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定抗骨质增生片中淫羊藿苷含量的方法，以期为进一步完善该制剂的质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器

U-3000型HPLC仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；3300LH型超声提取仪（上海科导超声仪器有限公司，功率：220 W，频率：40 kHz）；AE200型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

抗骨质增生片（兰州军区兰州总医院自制，批号：100618、100622、100624、101118、101125，规格：0.3 g/片）；淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110737-200415，纯度：98.5%）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（27∶73，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：25℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷300 μg的对照品贮备液。精密吸取上述贮备液1 ml，置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品10片，除去薄膜衣，研细，取样品细粉约0.2 g，精密称定，置于10 ml具塞锥形瓶中，加甲醇10 ml，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；再置于10 ml棕色量瓶中备用。

2.2.3 阴性对照溶液 取除淫羊藿的其他药材适量，按样品的制备工艺和配方比例制备阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以淫羊藿苷峰计≥3 000，保留时间为11 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.icariin

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液贮备液50、100、200、400、1 000、2 000 μl，分别置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以淫羊藿苷质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得淫羊藿苷的回归方程为y=24 537.59x－3 740.01（r=0.999 9）。结果表明，淫羊藿苷检测质量浓度线性范围为3～60 μg/ml。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限为11.2 μg/ml；当信噪比为3∶1时，得检测限为4.3 μg/ml。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积的RSD= 0.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：100618）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积的RSD=1.37%（n=6），表明供试品溶液在室温下8 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取同一批样品（批号：100618）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均含量。结果，淫羊藿苷的平均含量为1.18 mg/g，RSD=0.31%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：100618）适量，共6份，每份约0.1 g，分别置于10 ml棕色量瓶中，加入一定质量的淫羊藿苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）Tab 1 Recovery test results（n=6）

2.10 样品含量测定

取5批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算淫羊霍苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n=3）

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

笔者参考2015年版《中国药典》（一部）［11］和相关文献［3，12-14］中的溶剂，选择甲醇、50%甲醇、50%乙醇作为提取溶剂。结果，甲醇作为提取溶剂时淫羊藿苷含量最高，提取效果最好。因此，本试验选择甲醇为提取溶剂。

3.2 提取时间的考察

笔者考察了3个不同的超声提取时间（20、30、40 min）。结果，超声处理20 min时，样品中的淫羊藿苷提取不完全，超声处理30和40 min时淫羊藿苷提取量相当，且可将样品中的淫羊藿苷提取完全。因此，为了节约试验时间，本试验的超声处理时间选择为30 min。

综上所述，本方法操作简便、结果准确、重复性好，可用于测定抗骨质增生片中淫羊藿苷的含量。

［1］邹文孝，田维君，张春.抗骨增生片联合骨肽片治疗骨质增生症60例［J］.中国药师，2012，21（8）：93.

［2］冯晶.淫羊藿的研究进展［J］.湖北中医杂志，2012，34（9）：74.

［3］范梅娟.强力健身胶囊定性定量方法的研究［J］.药物分析杂志，2012，32（4）：697.

［4］ 范永春.乳欣安胶囊质量标准研究［J］.中成药，2010，32（5）：786.

［5］万婷，熊富良，高文天，等.骨康胶囊的质量控制研究［J］.中成药，2012，34（6）：1 096.

［6］张伏军，尹小玲，李卿，等.高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷和淫羊藿［J］.中成药，2011，33（7）：1 182.

［7］马晓星，韩翠艳，朱丹，等.益康药酒的质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（5）：101.

［8］翟宏颖，于林楠.淫羊藿苷对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌组织的保护作用［J］.中国药房，2015，26（16）：2 192.

［9］ Zhai YK，Guo XY，Ge BF，et al.Icariin stimulates the osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells via activating the PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG［J］.Bone，2014，66（9）：189.

［10］ Ma HP，Ma XN，Ge BF，et al.Icariin attenuates hypoxiainduced oxidative stress and apoptosis in osteoblasts and preserves their osteogenic differentiation potential in vitro［J］.Cell Prolif.2014，47（6）：527.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：327.

［12］焦守国，许学丽.HPLC法测定金乌骨通胶囊中淫羊藿苷的含量［J］.解放军药学学报，2009，25（6）：547.

［13］赵明宏，韩镌竹，王常丽，等.高效液相色谱法同时测定复方仙灵脾颗粒中淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的含量［J］.解放军药学学报，2011，27（1）：63.

［14］许红涛，李媛，何勇静，等.HPLC法测定二仙汤提取物中抗骨质疏松有效成分的含量［J］.中国药房，2015，26（15）：2 122.

（编辑：刘 柳）

Content Determination of Icariin in Kangguzhi Zengsheng Tablet by HPLC

ZHANG Guilin，MA Huiping，LI lanru，DONG Zhichen，HE Lei，JIA Zhengping（Dept.of Pharmacy，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Military Command，Lanzhou 730050，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of icariin in Kangguzhi zengsheng tablet，and provide a basis for improving the quality standard.METHODS：HPLC was performed on the column of Hypersil ODS2 C18with mobile phase of acetonitrile-water（27∶73，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 270 nm，column temperature was 25℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of icariin was 3-60 μg/ml（r=0.999 9）；limit of quantitation was 11.2 μg/ml，limit of detection 4.3 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recovery was 99.00%-100.67%（RSD=0.63%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the content determination of icariin in Kangguzhi zengsheng tablet.

Kangguzhi zengsheng tablet；Icariin；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）30-4291-03

2015-11-02

2016-08-18）

＊主管药师。研究方向：药物分析。电话：0931-8994665。E-mail：13639366065@163.com

#通信作者：副主任药师，博士。研究方向：药物分析。电话：0931-8994671。E-mail：mahuipingcxr@aliyun.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.37