UPLC法同时测定清喉利咽颗粒中5种成分的含量

牛小花，陈洪源，段玉平，黄 娇（重庆三峡医药高等专科学校药学系，重庆 404100）

UPLC法同时测定清喉利咽颗粒中5种成分的含量

牛小花＊，陈洪源#，段玉平，黄 娇（重庆三峡医药高等专科学校药学系，重庆 404100）

目的：建立同时测定清喉利咽颗粒中没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷含量的方法。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脱），流速为0.40 ml/min，检测波长为280 nm，柱温为30℃，进样量为1 μl。结果：没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷检测进样量线性范围分别为0.048～0.480 μg（r= 0.999 3）、0.012～0.120 μg（r=0.999 9）、0.016～0.160 μg（r=0.999 8）、0.022～0.220 μg（r=0.999 9）、0.072～0.720 μg（r=0.999 2）；定量限分别2.4、1.6、1.8、1.8、1.6 ng，检测限分别为7.5、5.0、5.6、5.6、5.0 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3.0%；加样回收率分别为96.64%～102.02%（RSD=2.00%，n=6）、95.86%～102.56%（RSD=2.86%，n=6）、97.24%～102.54%（RSD=2.10%，n= 6）、97.44%～102.60%（RSD=2.40%，n=6）、96.91%～103.13%（RSD=2.62%，n=6）。结论：该方法快速、准确，可用于同时测定清喉利咽颗粒中没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的含量。

超高效液相色谱法；清喉利咽颗粒；没食子酸；橙皮苷；新橙皮苷；柚皮苷；黄芩苷

清喉利咽颗粒是由黄芩、西青果、桔梗、竹茹、胖大海、橘红、枳壳等13味中药材组成，具有清热利咽、宽胸润喉的功效；常用于治疗外感风热所致的咽喉发干、声音嘶哑、急慢性咽炎、扁桃体炎等症，常用有保护声带的作用。清喉利咽颗粒收载于2015年版《中国药典》（一部）［1］以及《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》（第17册）［2］中，均仅将黄芩苷作为其质量控制指标，不能有效控制清喉利咽颗粒的质量；同时，超高效液相色谱法（UPLC）相比传统高效液相色谱法（HPLC）具有柱效高、分析时间短等优点［3-4］。为更好地控制该制剂的质量，笔者采用UPLC法建立了同时测定清喉利咽颗粒中黄芩苷、没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的方法。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-CLASS型UPLC仪，包括QSM四元溶剂管理器、PDAeλ二极管阵列检测器、SM-FTN样品管理器、CH-A型柱温箱、Empower3色谱工作站（美国Waters公司）；BP211D型万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-100DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司，功率：100 W，频率：40 kHz）；DISCOVER-III/IV型实验室专用超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

1.2 药品与试剂

清喉利咽颗粒（桂龙药业有限公司，批号：141206、141218、150124、150128、150425、150508、150515、150810，规格：5 g/袋）；没食子酸对照品（上海金穗生物科技有限公司，批号：20140412，纯度≥98.0%）；柚皮苷对照品（批号：MUST-12030914，纯度≥98.0%）、橙皮苷对照品（批号：MUST-11030701，纯度＞98.0%）、新橙皮苷对照品（批号：MUST-12040812，纯度≥98.0%）、黄芩苷对照品（批号：MUST-12040812，纯度≥98.0%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸均为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 min，10%A；8 min，40%A）；流速：0.40 ml/min；检测波长：280 nm；柱温：30℃；进样量：1 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷对照品适量，置于同一50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成每1 ml含没食子酸240 μg、柚皮苷60 μg、橙皮苷80 μg、新橙皮苷110 μg、黄芩苷360 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品约0.5 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理30 min，放冷后加甲醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和处方比例制备缺西青果、黄芩、橘红、枳壳的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以黄芩苷峰计≥20 000，保留时间为7.154 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 超高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.没食子酸；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷；5.黄芩苷Fig 1 UPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.gallic acid；2.naringin；3.hesperidin；4.neohesperidin；5.baicalin

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列线性溶液，取上述溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），结果见表2。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equations and linear rang

表2 定量限与检测限测定结果Tab 2 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为1.81%、1.16%、1.34%、1.08%、1.50%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为2.05%、1.54%、2.07%、1.80%、1.66%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取样品（批号：141206）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均含量。结果，没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的平均含量分别为11.22、2.89、2.93、2.88、7.39 mg/g，RSD分别为2.01%、1.68%、1.94%、2.08%、2.20%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品（批号：141206）适量，共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别置于25 ml量瓶中，加入一定质量的没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 样品含量测定

取8批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的含量，结果见表4。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验考察了甲醇-水、乙腈-水以及不同浓度乙腈-磷酸作为流动相时对5种成分分离度的影响。结果，乙腈-0.1%磷酸作为流动相时，5种成分分离效果最佳，峰型较好。因此，本试验选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

表3 加样回收率试验结果（n=6）Tab 3 Result of the recovery tests（n=6）

表4 样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of sample（n=3，mg/g）

3.2 检测波长的选择

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，在210～400 nm波长范围内进行全波长扫描。结果显示，没食子酸的最大吸收峰为271 nm，柚皮苷的最大吸收峰为283 nm，橙皮苷的最大吸收峰为284 nm，新橙皮苷的最大吸收峰为284 nm，黄芩苷的最大吸收峰为277 nm，这5种待测成分在280 nm附近均有最大吸收，故本试验选择280 nm为检测波长。

3.3 阴性样品的制备

清喉利咽颗粒中黄芩含黄芩苷［5-6］，西青果含没食子酸［7］，橘红含柚皮苷［8-9］，枳壳含橙皮苷和新橙皮苷［10-11］，故阴性样品为缺此四者的样品。

3.4 待测成分的选择

查阅相关文献［12-13］，已有关于清喉利咽颗粒中黄芩苷、橙皮苷等含量测定的报道，但尚未见没食子酸含量测定的报道。没食子酸是西青果的主要质量控制指标，西青果作为清喉利咽颗粒中的主要药材，有必要将其列为考察指标；亦未见同时测定橘红主成分（即柚皮苷）、枳壳主成分（即橙皮苷和新橙皮苷）、黄芩主成分（即黄芩苷）含量的报道。因此本试验将没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷列为待测成分。

综上所述，本方法快速、准确，可用于同时测定清喉利咽颗粒中没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1 562.

［2］ 卫生部药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂：17册［S］.北京：人民卫生出版社，1998：245.

［3］单玲玲，靳光乾，刘善新.UPLC、RRLC及UFLC在中药质量控制中的研究进展［J］.中华中医药杂志，2011，26（10）：2 340.

［4］赵明霞，胡基埂，吴方千，等.超高压液相色谱系统的研究进展［J］.分析试验室，2009，28（S2）：137.

［5］薛黎明，秦雪梅，张丽增.不同产地黄芩药材的黄芩苷含量测定及指纹图谱研究［J］.中成药，2008，30（1）：10.

［6］刘金欣，孟繁蕴，张胜海，等.UPLC同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A［J］.中草药，2014，45（10）：1 477.

［7］赵建平.西青果中没食子酸的含量测定［J］.广西中医学院学报，2003，6（4）：53.

［8］蔡晔芬.HPLC法测定橘红枇杷颗粒中柚皮苷的含量［J］.中国药房，2011，22（19）：1 798.

［9］刘晓涵，陈永刚，林励，等.化橘红中柚皮苷和野漆树苷含量同时测定方法的建立［J］.中药新药与临床药理，2010，21（6）：640.

［10］张宏武，封宇飞，邹忠梅.高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量［J］.中国新药杂志，2008，17（18）：1 600.

［11］林宗涛，陈世忠，王弘.HPLC法测定枳壳中6个二氢黄酮类成分的含量［J］.药物分析杂志，2013，33（2）：201.

［12］林冬杰.HPLC法测定清喉利咽颗粒中柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷的含量［J］.亚太传统医药，2010，6（7）：25.

［13］ 陈江涛，林冬杰.HPLC法测定清喉利咽颗粒中柚皮苷、橙皮苷的含量［J］.中国药师，2010，13（9）：1 275.

（编辑：刘 柳）

Contents Determination of Five Components in Qinghou Liyan Granule by UPLC

NIU Xiaohua，CHEN Hongyuan，DUAN Yuping，HUANG Jiao（Dept.of Pharmacy，Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404100，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of gallic acid，naringin，hesperidin，neohesperidin and baicalin in Qinghou liyan granule.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 0.40 ml/min，detection wavelength was 280 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 1 μl.RESULTS：The linear range was 0.048-0.480 μg for gallic acid（r=0.999 3），0.012-0.120 μg for naringin（r=0.999 9），0.016-0.160 μg for hesperidin（r=0.999 8），0.022-0.220 μg for neohesperidin（r=0.999 9）and 0.072-0.720 μg for baicalin（r=0.999 2）；limit of quantitation was 2.4，1.6，1.8，1.8，1.6 ng，limit of detection was 7.5，5.0，5.6，5.6，5.0 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no lower than 3.0%；recoveries were 96.64%-102.02%（RSD=2.00%，n=6），95.86%-102.56%（RSD=2.86%，n=6），97.24%-102.54%（RSD=2.10%，n= 6），97.44%-102.60%（RSD=2.40%，n=6）and 96.91%-103.13%（RSD=2.62%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is rapid and accurate，and can be used for the simultaneous determination of gallic acid，naringin，hesperidin，neohesperidin and baicalin in Qinghou liyan granule.

UPLC；Qinghou liyan granule；Gallic acid；Naringin；Hesperidin；Neohesperidin；Baicalin

R917

A

1001-0408（2016）30-4282-03

2015-11-01

2016-07-29）

＊讲师，硕士。研究方向：中药提取纯化。电话：023-58567305。E-mail：Xiaohua_206@163.com

#通信作者：讲师，硕士。研究方向：中药化学成分分析。电话：023-58556066。E-mail：Chyuan123@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.34