两种消化时间对成纤维细胞体外培养的影响

韩苗苗，闫旭龙，文 荣

(1.包头医学院，内蒙古包头 014040； 2.包头医学院第二附属医院心内科)



两种消化时间对成纤维细胞体外培养的影响

韩苗苗1，闫旭龙2，文 荣1

(1.包头医学院，内蒙古包头 014040； 2.包头医学院第二附属医院心内科)

目的：通过对比不同消化时间对成纤维细胞原代培养的影响，探索一种更为简便、可靠的实验方法，为原代心肌成纤维细胞的基础研究提供依据。方法：使用Ⅱ型胶原酶多次消化法，采用两种不同的消化时间对乳鼠心肌组织进行消化，利用差速贴壁法分离心肌细胞及心肌成纤维细胞，37 ℃孵育，使用台盼兰染色、免疫组化、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]等方法分析其形态、纯度、增殖能力。结果：消化时间8 min组的细胞总存活率为(94.7±0.6)%，10 min组为(93.9±0.8)%，二者比较差异无统计学意义(P>0.05)；心肌成纤维细胞存活率8 min组为(55.3±9.0)%，10 min组为(91.8±5.5)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；波形蛋白免疫组化，两组阳性细胞率均>95 %,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；增殖能力8min组为(5.33±0.80)，10 min组为(61.15±5.20)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：两种消化时间获得的心肌成纤维细胞在形态上、纯度上无明显差异，在增殖能力和心肌成纤维细胞数量上，10 min组优于8min组。

心肌成纤维细胞；消化时间；免疫组化

心肌成纤维细胞在心脏中是除心肌细胞外的主要细胞，约占心细胞总数的2/3，广泛存在于心肌细胞周围，作为桥梁连接心肌细胞，辅助其发挥作用，并参与多种病理过程，如心肌重塑、炎症、心肌梗死等，其中最严重的莫过于心肌纤维化。心肌纤维化是多种心肌疾病的终末阶段，一旦发生即不可逆转，严重影响人的生活质量与寿命，因此，对于心肌纤维化的研究越来越受到重视。在心肌纤维化的发生发展过程中，心肌成纤维细胞发挥着主要病理作用。要精准高效地研究心肌纤维化的发展机制及相关信号通路，获得量大、纯度高、活力佳的心肌成纤维细胞是关键一步。但原代心肌成纤维细胞的体外培养仍存在纯度不高、消化不全、传代后细胞质量不高等问题。本实验应用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作为刺激条件[1]，对比了不同消化时间对心肌成纤维细胞体外培养的影响，目的在于探索一种更为简便、可靠的实验方法，为心肌成纤维细胞的基础研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 出生1～3 d的Wistar大鼠，清洁级，由内蒙古大学实验动物中心提供[合格证编号:csxk(蒙)2002-0001]。

1.2 主要试剂 AngⅡ(Sigma)、DMEM高糖培养基(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰酶(碧云天生物技术公司)、MTT试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、小鼠抗波形蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、生物素标记兔抗大鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、生物素标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)、通用型SP免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验步骤 分别将20 mL含20 %胎牛血清培养基标记为8 min组与10 min组。在无菌操作台内，将1只乳鼠(性别不限)用75 %的酒精活体消毒，剪开乳鼠胸部皮肤及胸廓，暴露并剪下心，迅速置于装有无血清DMEM高糖培养基中，排出积血，剪掉上面1/3部分。再将此心移入下一个盛有无血清DMEM高糖培养基中，如此清洗3次，将心内残留的血洗净。随后将该心放入无菌小烧杯中，用无菌剪刀快速剪成约1 mm3并加入5 mL胶原酶Ⅱ洗涤后，将3 mL新的胶原酶Ⅱ与剪碎的乳鼠心肌组织块充分混合并消化，将1/2心肌组织块置于37 ℃水浴锅中消化8 min(8 min组)，另1/2置于同等条件的37 ℃水浴锅中消化10 min(10 min组)，然后弃去胶原酶Ⅱ，分别向心肌组织块中加入5 mL新的胶原酶Ⅱ，置于37 ℃水浴锅中再分别消化8 min、10 min，此时胶原酶Ⅱ中已含有大量被消化下来的心肌细胞与心肌成纤维细胞；收集细胞后，分别向心肌组织块中加入5 mL新的胶原酶Ⅱ，置于37 ℃水浴锅中再分别消化8 min、10 min，再次收集细胞；共收集6次含细胞的胶原酶Ⅱ，此时玻璃管中的心肌组织块已呈白色絮状。分别将8 min组与10 min组含细胞的胶原酶Ⅱ在常温下800转离心5 min，小心弃掉上清液，向两沉淀物中分别加入10 mL含10 %胎牛血清的DMEM(H)培养基并使之变成悬浊液，用300目滤网将悬浊液过滤。制备细胞爬片(差速贴壁法)：取一个24孔板，向每个孔中各加一个预先泡酸并高压灭菌的小盖玻片，分别向其中12个孔内加入8 min组的细胞悬浊液，另12个孔加入10 min组的细胞悬浊液，将此24孔板置于37 ℃孵箱中孵育70 min后置于倒置显微镜下观察，发现此时大部分细胞已贴壁。因心肌细胞贴壁需要时间较长，考虑此时贴壁的大部分是心肌成纤维细胞。将24孔板放于超净台内轻轻晃动，将孔内未贴壁的心肌细胞悬液吸出，并用无血清DMEM高糖培养基轻轻洗2遍，然后每孔内均加入1 mL含10 % FBS的DMEM(H)培养基，继续置于37 ℃孵箱中孵育，原代心肌成纤维细胞的细胞爬片制备完毕。24孔板中绝大部分细胞均为心肌成纤维细胞。

1.4 鉴定细胞成活率 用300目滤网将细胞悬浊液过滤后，分别取900 μL细胞悬浊液置于EP管中，分别加入100 μL 0.4 %台盼蓝染液，混匀后室温静置3～5 min，吸取10 μL充入计数板内，在倒置显微镜下观察，正常活细胞为折光性强的圆形细胞，死亡细胞被染成蓝色，取3次计数的平均值计算总细胞存活率。总细胞成活率(%)=[(总细胞数-染色细胞数)/总细胞数]×100 %。心肌成纤维细胞的成活率：差速贴壁结束后，将原代心肌成纤维细胞置于37 ℃孵箱培养，72 h后两组分别随机选一个孔的细胞，不清洗直接放入胰淀粉酶消化，将已经贴壁的细胞消化成细胞悬液，取900 μL细胞悬液置于EP管中，加入100μL 0.4 %台盼蓝染液，其它步骤同总细胞存活率。

1.5 HE染色鉴定心肌成纤维细胞的形态 将原代心肌成纤维细胞爬片放入孵箱孵育48 h，两组分别进行苏木素-伊红染色(HE染色)。于超净台内将细胞爬片分别用磷酸盐缓冲液洗两次，经4 %多聚甲醛固定30 min，再磷酸盐缓冲液洗3次，每次5 min，用滤纸吸干剩余磷酸盐缓冲液。加入适量苏木素染色液，室温静置30 min，蒸馏水冲洗10 min，浸入95 %乙醇5 s，用滤纸吸干乙醇，加入伊红染色液，室温染色30 min。70 %乙醇洗2次，用滤纸吸干乙醇，室温晾干。倒置显微镜下观察细胞形态。

1.6 免疫组化鉴定心肌成纤维细胞的纯度 将原代心肌成纤维细胞爬片放入孵箱孵育48 h后，两组分别于无菌超净台取出爬片，经4 %多聚甲醛固定，0.1 %triton 100室温孵育穿透，30 %过氧化氢室温浸泡，滴加5 % BSA封闭液，滴加适当稀释的一抗(抗Vimentin抗体或抗α-actin抗体)，于4 ℃过夜；滴加二抗(生物素化山羊抗鼠IgG)、链霉亲和素-生物素复合物，经二氨基联苯胺显色，室温显色，控制反应时间，经苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.7 鉴定心肌成纤维细胞的增殖能力 将300目滤网过滤后的细胞悬液放置70 min后在无菌超净台内吸出液体及漂浮的死细胞，用无血清DMEM高糖培养基轻轻洗2遍，分别加入5 mL含10 % FBS的DMEM(H)培养基，置于37 ℃孵箱中孵育48 h待培养瓶内细胞80 %融合后，将其分别接种于2个96孔板，24 h后加入AngⅡ，37 ℃孵育24 h，每孔依次加入10 μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]染色液，4 h后每孔中分别加入150 μL二甲基亚砜置于摇床15～30 min，待结晶溶解，于490 nm波长测定细胞吸光度。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总细胞成活率与原代心肌成纤维细胞成活率 8 min组与10 min组相比，差速贴壁前两组总的细胞存活率均大于93 %，差异无统计学意义(P>0.05)。差速贴壁48～72 h后，10 min组原代心肌成纤维细胞达80 %～90 %融合，8 min组原代成纤维细胞只有60 %～70 %融合，10 min组优于8 min组(P<0.05)。见表1。

表1 两种消化时间总的细胞存活率及原代成纤维细胞成活率对比

2.2 原代心肌成纤维细胞形态 原代心肌成纤维细胞在贴壁初期均呈圆形，折光性强，悬浮于培养基中，70 min后，大部分心肌成纤维细胞均已贴壁，只有少量的变为小梭形和三角形；24 h后，心肌成纤维细胞都变为三角形或长梭形，较大，排列紧密，胞浆透明，细胞核呈近圆形，细胞无自发搏动。苏木素-伊红染色后可见原代心肌成纤维细胞胞体较大，呈长梭形，细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色，核膜较为清晰，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，见图1a，图1b。原代心肌细胞细胞多为多角形，伸出伪足，核呈蓝色，细胞质呈淡红色，核膜清晰，见图1c。两种消化时间得到的心肌成纤维细胞在形态学上无明显差异。

图1a：消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞HE染色(400×)；图1b：消化时间为10 min的原代心肌成纤维细胞HE染色(400×)；图1c：消化时间为8 min的原代心肌细胞苏木素-伊红染色(100×)2.3 心肌成纤维细胞的纯度 原代心肌成纤维细胞中Vimentin抗原表达呈阳性，细胞质呈棕黄色，胞核呈蓝色，见图2a、图2b。在原代心肌成纤维细胞中，心肌细胞的标志性抗原表达为阴性，细胞质未被染色，细胞核呈蓝色，见图2c。8 min组与10 min组培养的阳性细胞率均>95 %。

图2a：消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞(400×)；图2b：消化时间为10 min的原代心肌成纤维细胞(400×)；图2c：消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞(400×)2.4 心肌成纤维细胞的增殖能力 传代过程中8 min组心肌成纤维细胞大量死亡，增殖率低；10 min组的心肌成纤维细胞的增殖快，增殖能力高于8 min组(P<0.05)。

3 讨论

目前对于原代心肌成纤维细胞的研究日益增多，而原代心肌成纤维细胞的培养方法繁杂多样，各有特点。我们探讨了两种不同的消化时间对于原代心肌成纤维细胞的影响。分离原代心肌成纤维细胞的方法多采用酶消化法[2]，在消化酶的应用上，可使用单一胰酶消化[3]，也可用胰蛋白酶(0.05 %)加胶原酶(0.1 %)共同消化[4]。在用于消化心肌细胞的胶原蛋白酶中，Ⅱ型最常用，可分次消化，也可过夜消化。由于心组织中含有很多胶原，使用胶原酶对细胞间的胶原纤维具有很好的消化作用，而且作用缓和，对细胞损伤小，所以本实验采用单纯胶原酶Ⅱ消化法。传统差速贴壁时间多为60～90 min[5]，60 min得到的心肌成纤维细胞量少，而80 min、90 min得到的心肌成纤维细胞纯度差，掺杂了大量的心肌细胞，因此本实验采用70 min差速贴壁，得到了量更多、纯度更高的心肌成纤维细胞。

本实验通过对比两种不同的消化时间对于原代心肌成纤维细胞的影响，发现两种消化时间培养的细胞在形态、纯度方面无明显差异，但在存活率与增殖能力方面有差异，探索出一套简便易行、产量大、纯度高、传代后质量高的原代心肌成纤维细胞的培养方法。

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Comparison between the influence of two kinds of digestion time on the in vitro culture of fibroblasts

HAN Miaomiao1,YAN Xulong2,WEN Rong1

(1.BaotouMedicalCollege,Baotou014030,China2.DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege)

Objective:To explore a simpler and more reliable experimental method, providing the basis for basic research of primary cultured cardiac fibroblasts by comparing the influence of different digestion time on the primary culture of fibroblasts. Methods:Type II collagenase was used to digest for many times and two different kinds of digestion time were used to digest the cardiac tissues of neonatal rats. The cardiomyocytes and cardifibroblasts were isolated by differential adhesion and were incubated at 37 ℃. Trypan blue staining, immunohistochemistry, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 -diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) etc. were used to analyze the morphology, purity and proliferation.Results:There was no significant difference between the survival rate of the two kinds of digestion time [8min (94.7±0.6)%，10min (93.9±0.8)% ]. The difference between the number of fibroblasts [(8min 55±9.0，10min 91±5.5)] was significant. In terms of vimentin immunohistochemical results, the positive rates of the two groups were both higher than 95 %. The proliferation of the 10 min group (61.15±5.20)was significant, but there was no significant change in the 8 min group.Conclusion：There is no difference in the shape or in the purity of fibroblasts between the two groups. But in terms of the ability to proliferate, the 10 min group is better than that of the controlled group . Besides , the 10min group can get more cardiac fibroblasts.

Cardiac fibroblast; Digestion time; Immunohistochemistry

闫旭龙

2016-03-04)