肾性高血压大鼠的血管功能变化*

陈珍珍， 胡 海， 王占黎， 文 荣

(包头医学院，内蒙古包头 014060)



肾性高血压大鼠的血管功能变化*

陈珍珍， 胡 海， 王占黎， 文 荣

(包头医学院，内蒙古包头 014060)

目的：观察肾性高血压大鼠血管功能变化，为肾性高血压的治疗提供依据。方法：将8周龄雄性SD大鼠随机分为2组对照组和实验组，每组5只，手术制备肾性高血压模型。术后，每周同一时间称重并检测大鼠血压值。手术干预4周后，取胸主动脉起始部进行血管功能检测,分别观察氯化乙酰胆碱(acelylcholie，Ach)、一氧化氮合酶抑制剂(N-nitro-L-argininemethyl-ester，L-NAME)、硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)、鸟苷酸环化酶抑制剂美兰(guanylate cyclase inhibitor，MB)，左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)对血管功能的影响；取主动脉弓切片，HE染色，观察形态学变化。结果：实验结束时，实验组大鼠血压值与对照组及造模前相比均升高(P<0.05)；对照组大鼠的血压值与造模前相比，差异无统计学意义(P>0.05)。分别比较在造模前、造模后实验组与对照组大鼠的体重变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。在Ach作用下，两组血管均舒张，实验组的终舒张百分比为92.41 %，对照组为151.10 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在L-NAME的作用下，两组血管均收缩，终收缩幅度实验组为0.14 g，对照组为0.15 g，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；MB使两组血管均收缩，终收缩幅度实验组为0.24 g，对照组为0.22 g，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。SNP使两组血管均舒张，终舒张百分比实验组为179.28 %，对照组为140.51 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。L-Arg使两组血管均舒张，终舒张百分比实验组为 8.97 %，对照组为6.00 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：4周手术干预后，肾性高血压大鼠血管内皮无明显器质性损害，主动脉起始段主要表现为血管反应性增强和功能失调。

肾性高血压；血管功能

目前，全球约有10亿人受高血压病困扰，而且是心血管疾病的重要危险因素[1]。肾性高血压是继发性高血压的一种，主要由肾脏实质性病变和肾动脉病变引起的血压升高，严重危害人类健康[2]。现阶段对高血压早期血管张力变化的临床或动物实验研究还较少。本实验采用离体血管灌流技术，观察肾血管性高血压大鼠早期血管内皮功能变化，研究早期大血管功能变化特点，并探讨其可能发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 去甲肾上腺素(norepinephrine，PHE)、氯化乙酰胆碱(acelylcholie，Ach)、一氧化氮合酶阻断剂左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-argininemethyl-ester，L-NAME)、硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)、鸟苷酸环化酶抑制剂美兰(guanylate cyclase inhibitor，MB)(sigma-Aldrich公司)，左旋精氨酸(L-arginine、L-Arg)购自上海沪试实验室器材股份有限公司；Krebs-Henseleit 缓冲液配制(mmol/L)：KCl 5.4,CaCl22.0 g,MgCl2·6H2O 1.1 g,NaCl 1.37,NaH2PO4·2H2O 0.4,NaHCO311.9 g,葡萄糖1.10975 g。BP-300A全自动无创血压测量系统、离体器官灌流装置、BL-420F生物信号采集与分析系统购自成都泰盟科技有限公司。

1.1.2 实验动物 清洁级8周龄SD大鼠10只，雄性，体重150～170 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(军)2012-0004。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备和分组 将10只8周龄SD大鼠采用随机数字法分为实验组和对照组，5只/组。适应性饲养1周后，实验组大鼠进行“两肾一夹”法结扎手术(左肾动脉中段套内径为0.2 mm的银夹)，对照组大鼠进行假性结扎手术(左肾动脉中段未套内径为0.2 mm的银夹)。术后3 d随饮水给予青霉素V钾片，0.5万单位/d，动态关注大鼠状态36 h，每周定时测量大鼠体重，测定尾动脉收缩压(systolic pressure，SBP)。以术前SBP为基准值，术后SBP上升≥30 mmHg为高血压模型标准，低者剔除。4周后开始后续实验。

1.2.2 血管功能检测 (1)血管环制备：将各组大鼠以3 %戊巴比妥钠(0.1 mL/100g体重)腹腔注射麻醉后，开胸迅速取主动脉弓及胸主动脉全段，置于4℃预冷Kreb，s缓冲液，去除血管外脂肪组织后，取胸主动脉起始部血管3～4 mm制成血管环，用不锈钢微型挂钩贯穿血管腔，将血管环悬挂于张力换能器上，置于盛有20 mL 37 ℃ Krebs-Henseleit 缓冲液的恒温浴管中，持续通入混合气体(95 %O2+5 %CO2)。施加前负荷1.0 g，以缓冲液平衡30 min，每15 min换1次液，待血管张力稳定后，用60 mmol/L KCl进行预刺激2次，使血管环平滑肌去极化，第2次血管环收缩达最大平台期后洗脱，开始正式实验。(2)血管环收缩和舒张功能检测：用10-4mol/L PHE(终浓度10-6mol/L)收缩血管，待张力上升达平台后，再由低到高加入不同累积终浓度(10-9～10-5mol/L)的Ach作用于血管环，记录各浓度Ach下血管环的舒张百分比；用同法检测终浓度(10-9～10-5mol/L)的SNP对血管张力的变化。将L-NAME(10-4mol/L)加入浴槽，孵育30 min后加入PHE(10-9～10-6mol/L)，记录血管环张力变化；用同法检测鸟苷酸环化酶抑制剂美兰MB(10-6mol/L)对血管环的张力变化的影响。将L-Arg(10-4mol/L)作用于血管环，孵育5 min后加PHE(10-6mol/L)，待收缩达平台期后，依次从小到大加入不同累积终浓度的Ach(10-9～10-6mol/L)，记录血管环张力变化。每次作用完成后，均用Kreb，s液冲洗水槽3次，重新调节血管环张力，平衡30 min，待基线稳定后进行下一步实验。

1.2.3 主动脉弓组织形态学观察 取实验组和对照组大鼠主动脉行4 %多聚甲醛固定，制作石蜡切片，常规HE染色，光镜下观察血管形态学改变。

1.2.4 统计学处理 舒张反应的数据以10-6moI/L PHE引起的稳定收缩为100 %，以其张力减少的百分数表示；收缩幅度以实际改变的幅度(g)计算。实验所有数据均采用(均数±标准差)表示，用SPSS 21.0进行统计分析，两样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠血压与体重变化 实验结束时，实验组大鼠血压值与对照组及造模前相比均上升(P<0.05)；对照组大鼠的血压值与造模前相比，差异无统计学意义(P>0.05)。分别比较在造模前、造模后实验组与对照组大鼠的体重变化，差异均无统计学意义P>0.05)。

表1 实验组与对照组前后血压及体重对比大鼠

2.2 主动脉组织形态学结果 光镜下观察实验组和对照组的大鼠主动脉组织切片，均可见主动脉外膜弹力纤维粗细不等，杂乱地纠缠在一起，放大后见这些纤维是由直径0.1～0.2 μm的微纤维组成的束状结构，一些微纤维从这一束又连到另外的束，形成不同粗细的纤维，实验组和对照组之间无明显差别。见图1。

2.3 Ach、L-NAME、MB对血管功能的影响 (1)Ach对血管功能的影响：在Ach作用下，两组血管均舒张，实验组的终舒张百分比为92.41 %，对照组为151.10 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2；(2)L-NAME对血管功能的影响：两组血管均收缩，终收缩幅度实验组为0.14 g，对照组为0.15 g，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3；(3)MB：两组血管均收缩，终收缩幅度实验组为0.24 g，对照组为0.22 g，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

2.4 SNP、L-Arg对血管功能的影响 (1)SNP：两组血管均舒张，终舒张百分比实验组为179.28 %，对照组为140.51 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。(2)L-Arg：两组血管均舒张，终舒张百分比实验组为 8.97 %，对照组为6.00 %，组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

3 讨论

高血压的发生发展易引起血管内皮细胞损伤[3]，使血管内皮功能发生改变。Ach具有较强的内皮依赖性舒张作用，本次实验证明，高血压大鼠大动脉内皮依赖性舒张功能呈降低趋势，这与Wang Y[4]的研究结果一致。左旋精氨酸(L-Arg)做为NO合成的底物，使血管内皮中NO的含量上升，值得注意的是，实验组在L-Arg孵育后表现出内皮依赖性舒张功能升高的趋势，表明此时血管内皮细胞尚未发生严重功能损害，高血压使血管内皮依赖性舒张功能降低的主要原因为NO量减少或其活性被抑制，与已有研究结果一致[5]。

L-NAME和MB分别抑制NO合酶的活性和NO靶部位的结合能力，使血管内皮中NO的表达降低，实验组大鼠L-NAME和MB孵育后PHE对血管收缩作用的影响表现不一致，提示高血压大鼠主动脉收缩功能的改变可能存在其他原因，其与NO的关系有待进一步研究。

SNP为非内皮依赖性舒张药物，实验组表现出舒张功能具有上升趋势，提示高血压可能引起血管非内皮依赖性舒张功能升高。

本实验大鼠高血压处于早期阶段，暂无明显器质性损害，主动脉起始段主要表现为血管反应性增强和功能失调，可能与高血压初期自身代偿有关。肾血管性高血压引起血管内皮细胞损伤主要受肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的调节[6]，实验结果显示，高血压对血管内皮功能的改变，主要表现为NO活性被抑制或其含量下降。有研究表明：当高血压引起的血管内皮NO表达量降低且血管紧张素受体2(AT2受体)未被抑制时，血管紧张素Ⅱ浓度升高，会刺激血管内皮细胞生成NO，对其进行反馈调节，可能引起高血压血管内皮功能紊乱。在高血压治疗初期，应对大血管内皮功能紊乱进行预防性药物治疗；血管内皮细胞损害是发生动脉粥样硬化的前兆，故预防动脉粥样硬化时，应着重对内皮细胞功能性损伤进行纠正。

高血压的发病机制复杂，动物实验和临床研究均表明血管反应性增强往往先于高血压的发生，提示血管反应性增强可能是高血压形成的原始因素之一。血管功能变化和血管重塑，由阻力血管逐渐向大血管发展。本实验观察了主动脉起始段在高血压早期的改变，而高血压不同时期、不同部位血管的结构和功能变化尚需进一步研究。

[1] Lynn M,Boyden,Murim Choi,et al.Mutations in Kelch-like 3 and Cullin 3 cause hypertension and electrolyte abnormalities[J].Nature,2012,482(7383): 98-102.

[2] Franchi F,Knudsen BE,Oehler E,et al.Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension[J].Hypertens Res,2013.36(9),770-775.

[3] Garland CJ.Compromised vascular endothelial cell SK(Ca)activity:a fundamental aspect of hypertension[J].Br J Pharmacol,2010,160:833-835.

[4] Wang Y,Ding Y.Berberine protects vascular endothelial cells in hypertensive rats[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(9):14896-14905.

[5] Chen CA,Wang TY.S-glutathionylation uncouples eNOS and regulates its cellular and vascular function[J].Nature,2010,468(7327):1115-1118.

[6] Araujo M,Wilcox CS.Oxidative stress in hypertension:role of the kidney[J]. Antioxid Redox Signal,2014,20(1):74-101.

Changes of vascular function in rats with renovascular hypertension

CHEN Zhenzhen, HU Hai, WANG Zhanli, WEN Rong

(BaotouMedicalCollege,Baotou014060，China)

Objective:To observe the changes of vascular function in rats with renovascular hypertension, providing basis for the treatment of Renovascular hypertension. Methods:8-week- old male SD rats were randomly divided into two groups (five rats in each group) and renovascular hypertension models were made by operation. The weight and blood pressure were measured at the same time every week. 4 weeks after the operation, the initial part of the thoracic aorta was taken to examine the vascular function, the influence of acelylcholie (Ach), N-nitro-L-argininemethyl-ester (L-NAME)， Sodium Nitroprusside (SNP), guanylate cyclase inhibitor (MB) and L-Arginine (L-Arg )on vascular function observed; the aortic arch was stained with hematoxylin-eosin staining, morphological changes observed. Results:When the experiment was finished, the blood pressure increased for the rats in the the experimental group, compared with that of the control group and before modeling. (P<0.05); the blood pressure for the rats in the control grop did not change ,compared with that before modeling(P>0.05); there was no difference in terms of the body weight before and after modeling in the two groups(P>0.05). Under the effect of Ach, the blood vessels of the two groups were diastolic, the percentage of the experimental group being 92.41% and that of the control group being 151.10%, the difference between which was not significant(P>0.05). Under the effect of L-NAME, the blood vessels of the two groups contracted, the final contraction in the experimental group being 0.14g and that of the control group being 0.15g, the difference between which was not significant(P>0.05); MB made the blood vessels in the two groups contract, the final contraction in the experimental group being 0.24g and that in the control group being 0.22 g, the difference between which was not significant (P>0.05). SNP made the blood vessels in the two groups diastolic, the end diastolic percentage of the experimental group being 179.28 % and that of the control group being 140.51 % , the difference between which was not significant(P>0.05).L-Arg made the blood vessels of the two groups diastolic, the end diastolic percentage of the experimental group being 8.97 % and that of the control group being 6.00% , the difference between which was not significant (P>0.05).Conclusion:4 weeks after surgery, there is no organic injury in the vascular endothelial function of rats with renovascular hypertension; there is increase in vascular reactivity and dysfunction in the initial part of the aorta.

Renovascular hypertension; Vascular function

国家自然科学基金(81460049)

胡海

2016-01-15)