pH示差法测定不同品系元宝枫叶片花青苷含量

杜晓茜+丰震+杨丽娟+许超+乔谦+任红剑+安凯

摘 要：采集秋季转色后的元宝枫无性系叶片作为试验材料，采用pH示差法测定其不同品系叶片中花青苷的含量。结果显示：用恒温震荡培养箱25 ℃震荡提取6 h提取效果最好；pH示差法选定pH 值是1.0和4.5，提取液的平衡时间是60 min。试验的平均回收率是96.66%，由此可见，该方法能有效消除溶液中杂质对测定结果的影响，可用于元宝枫花青苷的定量分析。在所测量的5个品系中，花青苷含量最高的品系是1-7号，含量为0.845 3 mg·g-1，5个品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。

关键词：元宝枫；pH示差法；花青苷

中图分类号：Q946.83+6 文件标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.008

Abstract： In this study， the leaves of Acer truncatum Bunge were studied， and their total anthocyanin contents in different strains were investigated by pH-differential method. The results showed that using constant temperature oscillation incubator 25 ℃ oscillation extraction 6 hours it presented the best effect， and the pH selected were 1.0 and 4.0， and the buffering time was 60 minutes. By this method， the average recovery rate was 96.66%，therefore， this method can be used to the quantitative analysis of anthocyanins in Acer， and pH-differential method could eliminated the influence of impurities. Among the five strains，the content of anthocyanin in 1-7 was the highest ，which was 0.845 3 mg·g-1； the average anthocyanin content of these five strains was 0.482 1 mg·g-1.

Key words： Acer truncatum Bunge； pH-differential method； anthocyanin

元宝枫（Acer truncatum Bunge），槭树科（Aceraceae）槭属（Acer.L），是北方优良的园林绿化树种。秋季元宝枫叶色转为黄色、橙色或鲜红色，花青苷含量非常丰富[1]。本试验通过测定不同色系元宝枫叶片中花青苷含量，探讨叶色与花青苷含量的关系，为高含量花青苷品系的开发利用奠定理论基础。

花青苷广泛存在于大多数彩色植物体内，是水溶性类黄酮物质的一种，同时也是一种天然的食用色素，具有很多优点，如水溶性好、食用安全等，目前已普遍被消费者所接受。此外，在健康养生方面花青苷也起到不可忽视的作用：能缓解视觉疲劳、增强记忆力，同时还能清除体内过多的自由基[2]，可以改善血液循环、预防心血管疾病、抗癌防癌[3]。元宝枫秋色叶中花青苷含量相当丰富，叶片中花青苷的开发利用价值潜力无限。

通过查阅文献发现花青苷的测定一般有3种方法：高效液相色谱法、单一pH法和pH示差法。高效液相色谱法具备高效、样品不被破坏、灵敏度高、分析速度快、易回收等优点，且方法精密度高、重复性好，但在不明确样品中的花青苷单体组成时，该方法的使用受到限制；单一pH法虽操作简单，但灵敏度低； pH示差法不仅操作方法简便、设备仪器价格低廉、便于推广，而且准确度较高、重现性好[4]。所以，本试验用pH示差法测定新选育品系花青苷含量差异，以筛选出高含量品系，发掘高含量品系在食品及保健品方面的应用潜力，为元宝枫新品系的育种推广提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

试验材料：本试验所用材料取自山东农业大学南校区试验田，均为嫁接繁殖的元宝枫无性系。共5个品系：1-1、1-6、1-7、6-1、6-2，前3个为秋季红色叶品系，后2个为秋季黄色叶品系。于2015年11月至12月期间叶片转色后采集叶片并进行试验。

试验仪器：UV-1600 型紫外-可见分光光度计（ 尤尼科仪器有限公司） 、电子分析天平（ 上海越平科学仪器有限公司） 、PHSJ-4A 型酸度计（ 上海雷磁创益仪器仪表有限公司） 、RE52CS-1 型旋转蒸发器 （ 上海亚荣生化仪器厂）、HZ-8211K型恒温震荡箱。

1.2 试验试剂

1.2.1 试验试剂 无水乙醇、浓盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠（天津市凯通化学试剂有限公司） 等。以上试剂均为分析纯。

1.2.2 试剂的配制 1%盐酸乙醇：浓盐酸与无水乙醇体积比1∶99配制。1.2 mol·L-1盐酸-70%乙醇溶液：浓盐酸、无水乙醇与去离子水体积比是1∶7∶2。pH计缓冲液：pH计自带的pH值为4.0和6.86的缓冲剂粉配制。

1.3 元宝枫花青苷含量的定性分析

1.3.1 最佳浸提温度的选择 称取1 g植物材料迅速放入研钵中，液氮研磨成粉状，溶于50 mL 1%盐酸乙醇溶液中，放于4 ℃冰箱静置过夜。另外，称取5份1 g植物材料研磨成粉后，然后放入装有1%盐酸乙醇溶液50 mL的锥形瓶中，至于 160 r·min-1震荡培养箱中避光震荡提取6 h，震荡温度分别设置成15，25，35，45，55 ℃[5]。浸提完成后过滤，残渣于530 nm处分别测定吸光度，确定最佳浸提温度。

1.3.2 pH值的选择 pH示差法pH值的确定：将上述浸提液10倍稀释后，用柠檬酸或柠檬酸钠调节其pH值构建pH梯度[6]，以pH值为横坐标绘制pH值-OD值曲线，确定测量最佳pH值及pH示差法的最适pH值。要求所选定的两个pH 值在其左右变动时OD值变化不大。

1.3.3 浸提液平衡时间的确定 在选定的最合适浸提温度下浸提后，对浸提液进行稀释，然后在选定的两个pH值条件下每隔10 min测1次提取液的吸光度，记录OD值随时间的变化。

1.3.4 回收率的计算 通过加入回收法测定本试验回收率和相对标准偏差。

1.3.5 不同品系花青苷含量的测定 将浸提液静置至反应平衡后，在已测得的最佳 pH 值下，测量花青苷的OD值，平行测定6 次，算出花青苷含量。

花青苷含量计算公式：花青苷含量（mg·g-1） = ΔDVFM × 1 000 /（εm）[7]

式中：ΔD为 pH 值为1.0，4.5 时吸光度的差值； V为稀释体积（单位，L）； F为稀释倍数； M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量449.2 g·mol-1；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数26 900 L·（mol·cm） -1；m为样品质量（单位，g）。

2 结果与分析

2.1 最佳浸提温度

相关研究表明，温度对花青苷的稳定性有显著影响。当温度升高到60 ℃时，浸提液中的绝大多数的花青苷会变成查尔酮式结构[8-9]，而浸提液的颜色也几近无色。所以，本试验以温度为变量设置温度梯度，以温度为横坐标绘制温度-OD值柱形图，通过OD值的测定来确定最佳浸提温度，结果如图1示。在温度为25 ℃时，浸提液的OD值最高；且通过对比发现当温度为15，25，35，45 ℃时浸提液的OD值相差不大，即浸提温度在15～45 ℃之间浮动时对花青苷浸提效果的影响较小；当温度为5 ℃时，浸提液的OD值相对较小，可见温度太低时，叶片中的花青苷会浸提不完全；在浸提温度为55 ℃时浸提液的OD值开始下降，即高温造成了花青苷结构的转变。综上所述，25 ℃为花青苷浸提的最佳温度。

2.2 pH值的选择

花青苷是极性化合物，易溶于水等非极性有机溶剂，在pH值不同的溶剂中由于分子结构的不同会呈现不同的颜色。在pH值小于或等于3的酸性条件下可以稳定存在，其颜色也随pH值的变化而变化，pH<7时为稳定存在的红色，pH>7时不能稳定存在[10]，所以，本试验在酸性介质中测定。以pH值为变量绘制的pH值-OD值曲线如图2所示。由此图可以得出：在pH值等于1的时候，花青苷含量最高即在pH值等于1时花青苷最稳定；且pH值在0.5～1.5、4.0～5.0之间变动时OD值上下变动幅度不大，花青苷存在相对稳定，符合pH示差法的试验要求。可以得出结论：本试验中示差法选定的pH值为1.0，4.5。

2.3 浸提液平衡时间

花青苷在不同pH 值的溶液中存在状态不一样[11]，在加入不同pH值的缓冲液后，必须静置一段时间，使溶液达到动态平衡后，再进行吸光度的测定。通过对浸提液稀释后吸光度的测定，结果见表1。结果表明，样品稀释60 min后OD值不再变化，因此，本试验选择的平衡时间为60 min。

2.4 回收率计算

将浸提液10倍稀释后取两份等体积的溶液（标号A、B）放入干燥器内50 ℃以下干燥。材料A完全干燥后一份加入之前一样体积的浸提液；另一份加入等体积的1.2 mol·L-1盐酸-70%乙醇溶液，测得量为加标量；将材料A测得的花青苷含量减去原花青苷浸提液中的含量计为实际测得量，重复测定3次。测定结果如表2所示。结果表明：样品最高回收率是97.14%，最低回收率是96.39%，平均回收率为96.66%，相对标准偏差是0.42%；回收率和标准偏差均符合试验要求，所以用本方法测定花青苷含量准确可靠。

2.5 不同无性系花青苷含量的测定

通过pH示差法测得的元宝枫各个品系的花青苷含量如表3所示。可以看出：花青苷含量最高的是1-7，含量为0.845 3 mg·g-1；花青苷含量最低的是6-1，含量为0.134 8 mg·g-1；5个品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。红色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黄色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，红色品系中花青苷平均含量是黄色品系平均含量的4倍。由此可知：本试验田所培育的无性系元宝枫叶片中花青苷的含量非常丰富，尤其是红色品系中的1-7号，高含量的花青苷使其在花青苷的提取应用方面起到不容忽视的作用，如加工成食品及保健产品。同时，高含量的花青苷使其叶色更鲜红，在秋季表现出优良的观赏特性，在同类型的秋季观叶树种中更具有园林应用的优势[12-14]。

3 结论与讨论

本试验从山东农业大学南校区试验田选择了5个不同品系的元宝枫，3个红色品系，2个黄色品系，通过pH示差法对其花青苷含量进行测定比较，同时对其浸提条件也进行了比较优化。试验结果显示：浸提温度和pH值对花青苷含量的测定有很大的影响，在温度为25 ℃和pH值为1的条件下浸提效果最佳；花青苷含量最高的是无性系1-7号，含量为0.845 3 mg·g-1；5个品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1，红色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黄色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，红色品系中花青苷平均含量是黄色品系平均含量的4倍。因此，高含量的花青苷使本试验田中的红色品系在提取色素和秋季叶显色方面都有很强的优势。

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