苇蘑液体培养条件的优化

赵安 王翟 班立桐 黄海东 杨阳 黄亮

摘 要：通过苇蘑菌丝体液体培养的单因素试验，初步确定苇蘑的较适生长条件：pH值为5～7；温度 25 ℃；转速 100～200 r·min-1；装液量50～90 mL。再经正交试验对培养条件进行优化，得出苇蘑的最适制种工艺为：初始pH值为6；温度恒定为25 ℃；转速保持150 r·min-1；装液量为90 mL/250 mL。在该培养条件下，苇蘑的菌丝干质量可达到19.4 g·L-1。在通气量为4.5 L·min-1条件下进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐培养，在44 h即达峰值19.9 g·L-1。

关键词：苇蘑；液体培养；菌丝干质量

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.033

Abstract： The optimum growth condition of liquid culture for Weimo was studied by the way of single factor test， including pH， temperature， rotating speed and liquid volume. The results showed that the range of growth conditions of Weimo are as follows： pH 5～7， temperature 25 ℃， rotating speed 100～200 r·min-1 and liquid volume 50～90 mL. Then the optimal spawn-making for Weimo was concluded by three factors three levels orthogonal experiment， and they are pH 6， temperature 25 ℃， rotating speed 150 r·min-1 and liquid volume 90 mL. Under the optimal growth condition， the dry weight of Weimo could reach 19.4 g·L -1. And Weimo spawns grew to a peak value 19.9 g·L -1 after cultured by 5 L fermenter， 4.5 L·min-1 ventilation， 44 h.

Key words： Weimo；liquid culture；mycelium dry weight

苇蘑为蜡伞科（Hygrophoropsidaceae）、拟蜡伞属（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，产于天津市宁河县七里海地区芦苇地。芦林苇海中多年败叶腐草厚积成为独特的苇蘑生长基质，在闷热的夏季形成特定湿度、温度和光照环境，苇蘑才破土而出。苇蘑味道极其鲜美，香味浓郁，远胜于其他蘑菇，当地人们采集后鲜食或晒干食用。近些年来，由于自然生态环境的变化，芦苇长势大不如前，苇地里形不成阴暗潮湿的环境，苇蘑等也就很少见到[2]。

目前国内外关于苇蘑的研究报道较少，班立桐等[3]初步研究了苇蘑不同溶剂粗提物组分的抗氧化活性，发现总提取物的抗氧化力最好，除总提取物外，苇蘑的乙酸乙酯可溶性组分总抗氧化力最高，苇蘑的脂溶性组分对超氧阴离子（O2-）清除能力低于水溶性组分，而对羟自由基（·OH）的清除能力相差不多。为了更好地保护这一珍贵的蘑菇品种，本课题组在获得苇蘑快速生长的液体培养基后，进一步研究苇蘑液体培养的最适生长条件，为更好地开发利用苇蘑提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌 种

苇蘑（Weimo）由天津农学院农学与资源环境学院生物技术系保藏。

1.2 培养基

（1）斜面培养基的制备[4-5]。取600 g草炭土，在一定量的清水中煮沸20～30 min，用4层纱布过滤，得滤液。向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管。

（2）液体培养基（g·L-1）：葡萄糖 15 g，乳糖 15 g，酵母膏 6 g，115 ℃灭菌20 min。

1.3 方 法

1.3.1 苇蘑培养条件的单因素试验 （1）设置pH梯度为4、5、6、7、8、9，按照最适培养基的配方，每组配制6个摇瓶，每瓶装液量为70 mL的培养基。接种完成后分别放入温度为20，25，30 ℃的恒温摇床中震荡培养，并观察记录。（2）将接种完成的三角瓶分别放入不同转速（100，150，200 r·min-1）的恒温摇床中培养7 d。锥形瓶中长出很多淡黄色的小菌球为最佳[3]。

1.3.2 苇蘑液体培养的正交试验 以苇蘑单因素试验结果为基础设计了3因素3水平正交试验，以确定苇蘑的最适生长条件。正交试验因素水平见表1[4]。

1.3.3 分析方法 待各试验组生长出大量淡黄色小菌球时，取5 mL菌液稀释检测各组菌球数，并取等体积（50 mL）菌液测干质量和多糖[6]。干质量为离心后用蒸馏水冲洗菌丝3次置50 ℃烘箱中烘至恒质量测得，多糖测定采用苯酚硫酸法。

2 结果与分析

2.1 培养温度对苇蘑生长的影响

通过在20，25，30 ℃ 3种不同温度、150 r·min-1条件下培养苇蘑，7 d后各培养基中均长出淡黄色的苇蘑菌球，检测各组菌球数和干质量，结果见图1。

在不同温度条件下的pH为6的试验组中菌丝干质量分别为5，7.8，5.6 g·L-1，可以看出25 ℃下，菌丝干质量最多。对比3个温度环境下的各组试验，可知25 ℃有利于苇蘑生长。

2.2 摇床转速对苇蘑生长的影响

苇蘑接种到在摇床转速100，150，200 r·min-1条件下分别进行培养7 d后，测得的菌丝干质量见图2。

对比不同转速下的培养，可以推测出苇蘑的生长需要一定的溶氧，转速太低不利于苇蘑的生长，150 r·min-1菌丝干质量最高，而200 r·min-1比150 r·min-1条件下的菌丝干质量略低，可见转速太快不一定有利于苇蘑生长。

2.3 初始pH对苇蘑生长的影响

通过图3可以看出，在同一温度条件下pH值为6的试验组中菌球数、干质量、多糖含量明显高于其他试验组，并且各指标变化趋势基本相同。从图3可以看出，pH趋于碱性时，苇蘑的干质量逐渐减小，多糖含量及菌丝球数变化趋势相同，可见苇蘑为一种酸性食用菌，但过酸和过碱均不利于菌体的生长[7]。结果表明其最适生长pH值在6左右，与羊肚菌液体发酵所需最适pH值相同[8]，而与适于桦褐孔菌液体发酵所需碱性pH值刚好相反[9]。

2.4 正交试验结果

2.4.1 极差分析 苇蘑经过7 d的液体菌丝培养后进行离心测菌体干质量并进行统计分析，结果见表2。经单因素试验发现，菌丝球数及多糖含量与菌体干质量正相关，故此处只列出各试验组的菌丝干质量。

由表2中的极差R可以看出， 初始pH对苇蘑生长的影响最大，其次为装液量及转速。从表中得出最优组合为A2B3C2，即pH 6，装液量 90 mL，转速 150 r·min-1。这与试验组中的最大值6号组合A2B3C1不一致，有必要进行一次验证试验，以确定苇蘑的最适生长条件。

2.4.2 验证试验 将正交试验极差分析的最优组合A2B3C2和试验组合A2B3C1进行重复试验，每组接种4瓶，经7 d培养后对菌丝干质量进行记录、分析，结果见表3。

由表3可知，试验组合A2B3C2条件下的苇蘑菌丝干质量均值高于试验组合A2B3C1，即A2B3C2条件更适合苇蘑生长，苇蘑的最适液体培养条件是：pH 值为6、温度 25 ℃、装液量 90 mL、转速150 r·min-1。

2.4 通气量对苇蘑液体培养的影响

以10%的接种量进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐通气培养，设定通气量为3，4.5，6 L·min-1进行比较试验，过程曲线见图4。

由图4可见，苇蘑的发酵罐培养后的干质量在44～48 h即达到峰值，时间远远短于摇瓶培养，可见发酵罐培养条件优于摇瓶。不同的通气量条件下，苇蘑的生长情况差异比较大，通气量由3 L·min-1增大至4.5 L·min-1后，菌体的干质量得到了大幅度提升，而进一步增大至6 L·min-1后，菌体干质量反而出现下降趋势。通气量可控制发酵罐中的溶氧处于合适的范围，进而促进菌体的快速增长及生长得率的增加[10]，苇蘑的液体菌种培养在适量的通气量条件下生长，于44 h可达峰值19.91 g·L -1，达峰值的时间远低于常见的珍稀食药用菌如杏鲍菇、桑黄、荷叶离褶伞等的6～8 d[11-13]。

3 结论与讨论

苇蘑为具有天津“肺叶”之称的七里海湿地的特色资源，其产出不仅需要特定的地理环境，还需要独特的气候条件。野生苇蘑生长于茂密的芦苇根部，采集非常困难，采集者有时在密集的芦苇丛中寻觅几小时而不得一子实体，而且苇蘑不一定每年均有产出，气候条件的变化导致几年都采集不到是常有的事。苇蘑的稀少及独特的味道促使这一野生资源2015年售价达4 000元·kg-1，而且往往价高而货缺。

七里海是华北大地渤海之滨的一颗璀璨明珠，七里海因南北宽 7 华里而得名，又名七里淀，古属神州九十九淀之一。古称七里海为“七里烟波”，属宁河八景之一。它在 20 世纪 60 年代以前曾有过几千年辉煌的历史，是津京唐三角地带极其难得的一片绿洲，是天津滨海地区既大又美的后花园，是我国第一个也是唯一的古海岸与湿地同处一地的国家级自然保护区，还是世界著名三大古海岸之一[14]。从20 世纪70 年代开始，由于湿地生态系统的脆弱性，加上人们在对湿地资源的开发中存在着许多不合理，极大地影响了湿地生态环境，破坏了生态平衡。七里海湿地的面积不断缩小，水源逐渐枯竭，植物群落严重衰颓。尤其是芦苇，在充足的热量和水分条件组合下，长势良好，植株高大，茎杆粗壮，生长茂密，曾覆盖了70%～80%的沼泽面积，形成绿色的芦林苇海[15]。由于沼泽面积缩小、土质退化和干旱无水，芦苇的长势也严重衰退，栖身芦苇地的苇蘑也逐年减少。此外，人为采集的增加，导致幼龄菇未完成生理成熟期即夭折，长此以往，芦苇地由于缺乏苇蘑孢子的存集，苇蘑将面临灭绝的危险。

为延续苇蘑的资源再生，多年来很多学者一直在研究人工栽培苇蘑技术，目前未有成功。笔者所在研究室长期研究苇蘑，以期通过液体发酵模式开发苇蘑产品，并对七里海地区的物种保护作一份贡献。在不同pH值、温度、转速、装液量下对苇蘑进行摇瓶振荡恒温培养，通过正交试验对培养条件进行优化，确定出苇蘑的最适合液体制种工艺。在该工艺条件下，苇蘑的菌丝干质量达到最大值：19.4 g·L -1，是未优化前的3.9倍。通气量为4.5 L·min-1条件下进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐培养，在44 h即达峰值，制种时间可大幅度缩短。

参考文献：

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