流式细胞仪脉冲补偿恢复算法研究

周 进, 娄小平,2, 张文昌,2, 刘 锋,2

(1.北京信息科技大学 光电测试技术北京市重点实验室，北京 100192;2.北京信息科技大学 光电信息与仪器北京市工程研究中心，北京 100192)



流式细胞仪脉冲补偿恢复算法研究

周 进1, 娄小平1,2, 张文昌1,2, 刘 锋1,2

(1.北京信息科技大学 光电测试技术北京市重点实验室，北京 100192;2.北京信息科技大学 光电信息与仪器北京市工程研究中心，北京 100192)

流式细胞仪数据采集过程中，触发阈值的设定导致脉冲信号信息完整性的缺失,从而造成后续脉冲参数提取误差增大；针对以上问题，根据流式细胞仪脉冲信号类高斯特性，利用MATLAB分别采用斜线法、高斯拟合法、抛物线法以及灰色预测法对阈值以下的脉冲缺失信息进行补偿恢复；同时，分别对4种方法补偿恢复后的脉冲进行脉冲峰值、脉宽、脉冲面积3个参数的提取，并进行误差比对；仿真结果表明，触发阈值的设定主要对脉宽及脉冲面积产生影响；灰色预测法的脉冲补偿恢复误差最小，可用于流式细胞仪底层在线脉冲补偿恢复。

流式细胞仪;信号预测;高斯脉冲;脉冲补偿

0 引言

流式细胞仪是融合流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术为一体的新型高科技仪器。利用单一或多路激光，照射形成的单细胞流中的细胞，通过采集激发出来的荧光信息或(和)散射光信号进行参数提取和分析，进而对细胞(人体)的健康状态进行诊断。在细胞生物学、细胞周期动力学、免疫学、血液学及肿瘤学等领域具有广泛的应用。细胞中激发出来的荧光通过光电转换、模拟放大、模数转换，最终成为数字信号。数据采集过程中脉冲信号参数提取准确性将直接影响整机检测精度[1-4]。

数据采集过程中，为了去除一些杂散噪声而设定一个触发阈值，触发阈值不为零导致脉冲信号阈值以下的信息缺失，目前国内外主要用矩形补偿的方法对缺失的信息进行恢复，矩形补偿的宽度为阈值与脉冲信号的相交长度，高度为阈值的大小。然而用此矩形对脉冲信号进行补偿只是对缺失信息进行大致恢复，信号恢复精度较低，影响参数提取中的脉冲面积和脉冲宽度等参数，进而造成流式细胞仪变异系数(coefficient of variable, CV)增大[5-10]。

本文借助MATLAB仿真工具，利用叠加了随机噪声的高斯信号模拟实际流式细胞仪采集到的数字信号，分别使用斜线法、高斯拟合法、抛物线法以及灰色预测法对阈值以下的脉冲信号进行补偿恢复，之后对补偿恢复后的脉冲信号进行参数提取并进行误差对比分析。

1 数据采集及参数提取

经荧光染料标记的细胞在激光的照射下激发出特征荧光及散射光，对特定光信号进行测量并对表征细胞特征的脉冲参数进行提取，最终根据脉冲参数进行统计学分析及健康状态诊断。其中，数据采集过程主要是接收前向散射光(forward scatter, FS)、侧向散射光(side scatter, SS)及各路荧光信号(fluorescence, FLn)，通过光电转换形成电脉冲信号，并对表征细胞特征的脉冲参数(峰值、宽度及面积)进行快速提取[4]。

由于光电转换之后的电脉冲信号带有所检测光脉冲信号的特征，故通过提取电脉冲信号中的参数(主要有脉冲峰值、脉冲面积和脉冲宽度)即可得到表征细胞脉冲的状态信息。电信号参数提取的准确性及实时性将直接影响到仪器的性能指标以及医疗上进行诊断的准确性。脉冲信号及相应参数定义如图1所示。

图1 脉冲参数示意图

图1中的阈值实际中用作ADC的触发电压，当采集到的脉冲信号电压超过阈值时，ADC开始进行模/数转换。设定阈值既可以减小由于模数转换芯片工作在边界转换状态下引入较大的转换误差，也可以避免由细胞碎片及其它杂散噪声等引起的微小脉冲干扰，但同时也会导致信号信息的缺失，使得对脉冲面积及脉冲宽度的提取出现偏差。阈值设定对脉冲参数提取的影响如图2所示。

图2 阈值对脉冲参数提取的影响

在图2中，当不进行脉冲补偿恢复时，采集到的信号只有阈值之上的数据，此时，只能通过利用A2表示脉冲面积，L1表征脉冲宽度。

传统的矩形脉冲恢复方法直接利用L1为宽，Th为高的矩形做补偿。补偿后，A2+A3表示脉冲面积、L1表示脉冲宽度。从图中可以看出，矩形恢复算法相较于不进行脉冲恢复，可以将脉冲面积进行部分恢复，但无法对A1及A4进行恢复，若阈值设置较高则对面积的提取存在比较大的缺失。此外，矩形恢复算法使脉冲宽度L2得不到补偿。

2 脉冲补偿恢复算法

在流式细胞仪中，荧光和散射光在激光照射下，其产生的脉冲信号具有类高斯特性，故采用叠加了随机噪声的高斯信号对其进行表征。

阈值之上的数据可以用序列y表示：

(1)

式(1)中，x为表示荧光分布的高斯脉冲序列，r为叠加的随机噪声序列,y={y(1),y(2),…,y(n)}。

结合现在普遍使用且处理方式较为简单的方法，对比了以下几种补偿方式：斜线法、高斯拟合法、抛物线法以及灰色预测法。其中，前3种方法均使用最小二乘法进行曲线拟合并完成预测，灰色预测方法则利用已知的数据构建模型对序列进行逐个预测，并通过预测值不断更新模型。上述方法均采用局部预测模型。

(2)

(3)

f=A0+A1x+A2x2

(4)

(5)

其中，公式(2)为斜线法(取m=1)和抛物线法(取m=2)的模型，公式(3)为高斯拟合法的模型。

通过对公式(3)两边取对数运算，得到等式(4)，则将高斯拟合法构建成为曲线拟合模型。最终3种方法均可通过求解得到类似公式(5)的一个矩阵，求得相应系数，从而得到预测曲线[5-8]。

取序列(1)中y的两端N项序列作为灰色预测模型的原始数据(以临近右端阈值的N个序列作为恢复模型为例)Y0:

(6)

对Y0进行一次累加，生成序列G0：

(7)

根据序列(7)的紧邻均值生成序列S0:

(8)

建立所需的一阶微分方程

(9)

将微分方程(9)用矩阵表示：

(10)

(11)

(12)

通过求解白化微分方程(12)，得到灰色微分式(9)的解为：

(13)

(14)

在处理过程中，斜线法、高斯拟合法和抛物线法都是利用阈值之下的数据具有变化趋势平缓、向两边逐渐变弱趋于零的特点，依照最小二乘法拟合出相应的变化曲线，最终利用曲线进行阈值之下的曲线恢复，得到所需的脉冲补偿参数。

上述3种方法在进行脉冲补偿的过程中，利用阈值边界两端的数据进行处理。在处理过程中，如果选取较大的阈值，则阈值之下两端数据变化较大，使得通过边界两端的数据进行预测导致较大的误差；而如果选取较小的阈值，则采集了较多的接近零的数据，这部分的数值在利用模数转换时，接近模数转换器的转换极限，且阈值选取过小会使得一些杂散噪声进入到转换中，转换之后的数值也会有较大的误差。在实际应用中，由于采集到的细胞所携带的信息量不同，所体现出来的荧光强度不同，所以固定一个阈值会使得对不同的信号而言有过大或过小的可能，而动态调节在快速处理中，实时性要求极高，目前还不利于实现动态调节阈值。因此在细胞变动大的情况下，会使得阈值选取不恰当，这3种方法都不能提供较强的抗扰动能力。

为了提高抗扰动能力，选用灰色预测的方法。通过对阈值边界以上的前N个值进行计算，预测出下一个点的值，最后利用这N+1个数据，舍弃掉第一个数据，组成一个新的N个数据组，通过这新的N个数据，再进行下一个数的预测，依次预测出阈值以下的数据。最后利用预测出来的数进行更加精准的参数计算。

利用灰色预测算法的优点是抗扰动能力强，计算较为简便，准确度高；缺点是计算量相对复杂，消耗时间相对较多。

3 实验及数据分析

基于以上理论，利用MATLAB搭建仿真系统。

对高斯脉冲信号叠加随机噪声，并对最终的脉冲信号进行S-G滤波处理。对处理过后的脉冲信号进行阈值截断。利用上述方法，分别对该脉冲阈值以下的数据进行恢复处理，并计算3个参数：峰值(P)、脉宽(L)和面积(S)。3个参数的计算方法一致，分别采取如下的计算方式得到参数值：

假定拟合之后的高斯脉冲序列为y(i)，其中i=1,2,3,…,n。

(15)

L=k2-k1+1

(16)

(17)

式(15)～(17)中，max表示取到最大值点的序列号，P表示所求峰值；L表示所求脉宽，其中k1,k2分别表示在取定有效高斯脉冲的情况下，脉冲左右两端的序列值；S表示所求面积，在高频采样情况下，用分段直角梯形累加和来表示该段的积分面积是可行的。

利用上述3个参数的计算方法，分别对用不同恢复方法所得参数进行计算，得到表1所示的数据。

表中各行所对应的值为该种方法与真值(取P=1.89V,L=3.00μs,S=139.00)的差值,Th为设定的阈值大小。

通过分析表1中数据，可以得出：

(1)进行补偿能够大大减少计算脉宽和面积带来的误差，而在这些补偿方法中，矩形补偿所带来的准确性最小，灰色预测法稳定性高，能达到很理想的补偿效果。

(2)除灰色预测方法外，其他方法受阈值设定的影响因素都很大。

(3)这些补偿方法中，阈值选取合适，对于这几种方法能够都能够提高恢复信号的准确性。因此，在实际检测过程中，为进一步满足在线测量时的时效性，选取适当的阈值，通过对比表1中第一组和第四组可知，利用斜线法替换矩形补偿也能达到接近灰色预测的准确性效果。在考虑准确性和时效性两方面选用斜线法能得到较大的平衡。

4 结束语

本文针对流式细胞仪信号参数提取研究了补偿算法，利用仿真实验进行了理论验证，通过对比实验，验证了信号恢复的必要性以及提高信号恢复准确性的方法。通过该实验，得出了利用灰色预测方法可以显著提高参数准确性的结论，并且在充分考虑快速检测的基础上，利用斜线法也能达到优于矩形补偿的在线优化效果。依靠灰色预测方法，提高参数提取的准确性，为医学上利用完整数据离线分析、进行二次确诊提供更加有力的诊断依据。通过本次实验，可以验证所提补偿方法的有效性。本文设计的恢复方法也将进一步运用于硬件设计，优化硬件电路的参数提取算法。

表1 仿真方法结果误差比对表

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Study of Multiple Algorithms about Pulse Compensation

Zhou Jin1, Lou Xiaoping1,2, Zhang Wenchang1,2, Liu Feng1,2

(1.Beijing Key Laboratory of Optoelectronic Measurement Technology, Beijing information Science and Technology University, Beijing 100192,China; 2.Beijing Engineering Research Center for optoelectronic information and instrument,Beijing Information Science and Technology University，Beijing 100192，China)

In flow cytometer (FCM) researching field, pulse parameters (width, peak, area, etc.) extraction plays important role for particle information post-processing. According to principle of the flow cytometer, special circuit is designed to collect the pulses, and the threshold is used to trigger effective signal catching and parameters calculating. The measurement accuracy is affected by the information missing below system threshold. In order to improve system performance, pulse predicting algorithms are introduced in this paper. Three parameters by recovering are extracted and compared with the parameters of the signal obtained before the restoration.

FCM； signal predicting； Gaussian pulse； pulse compensation

2015-10-03；

2015-10-29。

北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目(IDHT20130518)；长江学者和创新团队发展计划资助(IRT1212); 北京市教委科研计划项目(KM201511232006)。

周 进(1990-)，男，江西新余人，硕士研究生，主要从事生物医疗检测技术及仪器方向的研究。

1671-4598(2016)03-0244-04

10.16526/j.cnki.11-4762/tp.2016.03.067

TP274

A