炭化竹席中罗丹明B的高效液相色谱荧光检测法

段俊敏， 佘佳荣， 黄 丽， 黄 军

(湖南省林产品质量检验检测中心, 湖南 长沙 410007)

炭化竹席中罗丹明B的高效液相色谱荧光检测法

段俊敏， 佘佳荣， 黄 丽， 黄 军

(湖南省林产品质量检验检测中心, 湖南 长沙 410007)

通过对竹席样品中的罗丹明B用乙醇水溶液提取，经C18反相色谱柱分离，荧光检测器进行测定。结果表明： 罗丹明B在0.1～200 μg/L浓度范围内线性相关系数为0.9999，在20、500、5000 μg/kg添加水平时的回收率为80.6%～92.8%，相对标准偏差为1.3%～2.1%(n=6)，定量检出限为5.0 μg/kg。高效液相色谱荧光检测法适用于竹席中罗丹明B的测定，并具有简单、快速、准确等优点。

炭化竹席； 罗丹明B； 高效液相色谱； 荧光检测

近年来，炭化竹席因颜色偏深黑，符合人们深色更大气、上档次的审美观，受到消费者们的推崇。高温炭化工艺分解了竹材内的糖分、淀粉、脂肪及其它营养物质，破坏了适合虫卵生存的环境，不易出现虫蛀。且处理后的竹席比普通竹席更坚硬，不易起竹刺。

但有些商家偷工减料，用工业染料将竹席染制成炭化竹席的颜色，冒称炭化竹席。在夏天竹席直接接触皮肤，染色竹席上有工业染料的残留，不利于身体健康。罗丹明B又名碱性玫瑰精，是染制炭化竹席常用的染料。有关研究指出，罗丹明B会引起老鼠皮下组织生肉瘤，半数致死量(大鼠，经口)500 mg/kg[1]。由于罗丹明B具有潜在的毒性、致癌、致突变性现已禁用作为食品染色剂[2]与化妆品着色剂[3]。罗丹明B具有三苯甲烷类碱性染料结构，是一种具有鲜桃红色的人工合成染料[4]，具体化学结构式见图1。

图1 罗丹明B的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of rhodamine B

因此，需尽快建立炭化竹席中罗丹明B的检测方法，以期达到区分目前市场上染色竹席与炭化竹席的目的。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂

1.1.1 实验仪器 高效液相色谱仪(岛津LC2010A，岛津公司)，带荧光检测器(FLD)；电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、WJX — 200型高速多功能粉碎机；冷凝回流装置；标准筛：60目，100目；0.45 μm尼龙滤膜；标准物质： 罗丹明B( Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，纯度≥98.6 %；甲醇(色谱纯)、乙醇(分析纯)、水(一级水)。

1.1.2 实验试剂 标准储备溶液： 准确称取适量罗丹明B标准品，用甲醇配制成浓度为100 μg/mL的标准储备溶液。此溶液在0～4 ℃下避光保存。标准工作液：根据需要移取适量标准储备溶液，用甲醇水1∶1的溶液稀释成0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的标准工作溶液，置于0～4 ℃下避光保存。

1.2样品前处理方法

1.2.1 干燥、恒重 称取去除装饰后的炭化竹席样品100 g左右，在(103±2)℃条件下干燥至质量恒定(半小时之后，两次称量所得的质量差小于称量样品质量的0.1%，即为质量恒定)，备用。

1.2.2 粉碎、过筛 将炭化竹席样品处理成适当大小，放入粉碎机中粉碎，使样品均通过60目筛。并去除过筛后样品中100目以下的样品，即得60目至100目之间的样品。密封保存于干燥器中，备用。

1.2.3 试样提取 称取(1.2.2)中处理好的60目至100目之间的样品2 g(精确到0.0001 g)，于150 mL圆底烧瓶中，准确加入100mL乙醇水1∶1的溶液。记录加入溶液后，圆底烧瓶的总质量。在70 ℃水浴中加热、回流2 h；将圆底烧瓶取出，冷却至室温后，再次称重，并补足减失的乙醇水质量。摇匀，静置5 min后，吸取上清液，过0.45 μm尼龙有机滤膜，转入样品瓶中，待分析[5-6]。

1.3液相色谱条件

色谱柱： Inert Sustain C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，或与此相当者；流动相A为H2O；流动相B为甲醇；梯度洗脱：0.01→5 min B∶60%；5→35 min B∶60→95%； 35→38 min B∶95% ；38→42 min B∶95→60%；42→50 min B∶60%；流速：1.0 mL/min；荧光检测器 FLD 激发波长Ex∶550 nm ；发射波长 Em 580 nm ；柱温箱温度：40 ℃。

1.4测定方法

分别向液相色谱仪注入等体积的标准工作液和样品溶液，按照上述色谱条件进行检测，记录色谱峰面积，并与相应的标准峰面积进行比较，外标法定量[7]。

2 结果与分析

2.1前处理条件的确定

2.1.1 过筛目数的确定 实验中采用的高速多功能粉碎机，粉碎程度为50～300目。比较了将同一样品制备成60～100目与100目以下时测定值与重现性的差别，实验数据见表1。相对标准偏差的数据表明60～100目之间的样品，具有更好的重现性、稳定性。因为100目以下的样品粉碎粒度含100～300目，比表面积相差较大，样品的均匀性较差。

表1 60～100目与100目以下样品的测定数据比较Tab1 Thedeterminationdatacomparisonofthesamplebelow100meshto60～100mesh样品名称60～100目100目以下浓度(μg/kg)RSD(%)浓度(μg/kg)RSD(%)炭化样品1698614812125035187197染色样品1487563861855842623382072530125

2.1.2 提取条件的选择 提取方式的比较：称取同一样品2 g左右加入150 mL圆底烧瓶中，超声1 h后，过0.45 μm有机膜，装入样品瓶中待分析；另一份按1.2.3样品处理步骤进行处理，均采用双平行实验。对至少3个以上样品进行了上述实验，发现加热回流2 h比超声1 h的提取效果要好。

提取溶剂的比较：比较了不同提取溶剂：乙腈，乙腈∶水1∶1，甲醇，甲醇∶水1∶1，乙醇∶水1∶1对竹席中罗丹明B的提取率，提取结果如图2所示。实验结果表明上述溶剂均能有效提取竹席中罗丹明B，因乙腈、甲醇均具有一定的毒性，本实验选择了低毒、价廉的乙醇水1∶1作为提取溶剂。

图2 不同溶剂提取效果比较Fig.2 The compare of the effect of different solvents extraction

提取时间的比较：以乙醇： 水1∶1为提取溶剂，比较了不同提取时间对罗丹明B提取效果的影响，提取结果如图3所示。实验比较了30、60、90、120、180、240、300 min时罗丹明B的提取含量。测定结果显示，开始时，随时间增加溶剂中罗丹明B的含量迅速增加，但到达一定时间后，提取含量趋向饱和。为保证提取含量测定的稳定性，实验选取了饱和点之后的120 min作为提取时间，以达到良好的提取效果。

图3 不同提取时间对竹席中罗丹明B提取效果的影响Fig.3 Performance evaluation on the extraction time of rhodamine B in bamboo mat

2.2色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择 比较了甲醇水、甲醇与0.3%乙酸水为流动相时的分离情况[8]。水相中加酸后，并未显示出更好的分离能力。从图4标准品色谱图可以看出，以甲醇水为流动相时，罗丹明B出峰峰形良好，无前延与与拖尾现象。

图4 罗丹明B10 μg/L标准品液相色谱荧光谱图Fig.4 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B standard

竹席的乙醇水提取溶液经C18柱分离，强极性物质先出峰，弱极性物质后出峰。实验比较了乙腈水、甲醇水为流动相时，样品的分离情况。一般情况下，乙腈相对甲醇具有更好的洗脱能力。而竹席样品的乙醇水提取溶液中，罗丹明B出峰附近有极性相近的杂峰，甲醇水为流动相有更好的分离能力，见图5、图6。

图5 原竹样品的液相色谱荧光谱图Fig.5 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bamboo

图6 染色竹席样品的液相色谱荧光谱图Fig.6 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in dyeing bamboo mat

2.2.2 梯度洗脱程序的选择 以A相纯水，B相甲醇为流动相，梯度洗脱的程序最终确定为0.01→5 min B 60%；5→35 min B 60%→95%。开始时，采用40%的水相促进样品中不同极性物质的分离，后采用高有机相进行洗脱，使得目标化合物

罗丹明B获得良好的峰形，见图7。即使在染色竹席样品中，罗丹明B附近干扰峰较多的情况下，分离度仍能达到1.6以上，理论塔板数60000多，见图6。

图7 漂白竹席样品液相色谱荧光谱图Fig.7 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bleached bamboo mat

2.3罗丹明B检出的确认

在优化实验条件下，依据色谱保留时间定性，原竹、漂白竹席、炭化竹席、染色竹席样品中均有罗丹明B的检出，见图8；而平行的空白对照中，没有罗丹明B的出峰,见图9。且染色样品中罗丹明B含量远高于其它样品。

图8 原竹、炭化竹席、漂白竹席、与罗丹明B10 μg/L标准品的对比液相色谱荧光谱图Fig.8 A comparison of HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bamboo, thermo-modified bamboo mat, bleached bamboo mat and rhodamine B standard 10 μg/L

采用色谱保留时间定性的方式，竹席制品中均有罗丹明B的出峰，为确认该出峰为同一物质，而非该色谱条件下保留时间一致的其它化学物质，按照《SN/T 2430-2010 进出口食品中罗丹明B的检测方法》[9]中液相色谱—质谱/质谱条件，采用多反应监测模式，定性、定量离子对数据见表2，进行了原竹、炭化竹席、染色竹席样品中罗丹明B的检测和确证，均有罗丹明B的检出见(图10～图13)，且罗丹明B的检出含量与荧光检测方法检出的含量基本一致[10-11]。

图9 空白对照的液相色谱荧光谱图Fig.9 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in blank control

表2 罗丹明B定性离子对、定量离子对Tab2 Qualitativeion⁃pairandquantitativeion⁃pairwereselectedforrhodamineB化合物罗丹明B母离子(m/z)子离子(m/z)定量离子对443399定性离子对443355

2.4标准曲线和线性范围

以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，计算标准曲线回归方程。

在0.1～200 μg/L浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程Y=22204.07X+717.23，R=0.9999。

图10 罗丹明B标准溶液的多反应监测离子色谱图Fig.10 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatograms for rhodamine B standard

图11 原竹样品溶液中罗丹明B的多反应监测离子色谱图Fig.11 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in bamboo

图12 炭化竹席样品溶液中罗丹明B的多反应监测离子色谱图Fig.12 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in thermo-modified bamboo mat

图13 染色竹席样品中罗丹明B的多反应监测离子色谱图Fig.13 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in dyeing bamboo mat

2.5方法的回收率和精密度

在优化实验条件下，测定了添加在20 、500、5000 μg/kg加标水平时的罗丹明B的回收率，分

别进行回收率和重现性的计算，结果见表3。由表可见，该方法具有较高的准确度与可靠性[12]。

表3 竹席样品中罗丹明B的加标回收率(n=6)Tab3 TherecoveryofstandardadditionforrhodamineBinbamboomat(n=6)添加水平(μg/kg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)208268158147927808078062150093393090894194391292816500090989690489089592290313

2.6检出限

本方法中罗丹明B的检出限用两种方法表示：检测限(LOD)0.5 μg/kg(S/N>3)，定量限(LOQ)为5.0 μg/kg(S/N>10)。

2.7实际样品的测定

在优化实验条件下，对4个原竹，3个漂白竹席，10个染色竹席，6个炭化竹席样品中罗丹明B含量进行了测定，发现染色样品中罗丹明B的含量与其它样品中罗丹明B含量有数量级的差别，部分样品的测定值见表4。

表4 不同竹席样品中罗丹明B的含量测定(n=4)Tab4 DeterminationofrhodamineBindifferentbamboomatsamples样品名称/序号测定浓度(μg/kg)平均浓度(μg/kg)RSD(%)原竹118222423221202858679758164漂白竹席189928894913026365626864411656864776986炭化竹席250475150503537681847579541488674621049298506484875638染色竹席263574631936111661470623382034890845095512844130146647944393994172436304396433926757

3 结论与讨论

本文通过高效液相色谱 — 荧光检测法建立了一种快速、灵敏、简单的测定炭化竹席中罗丹明B含量的方法，该方法具有前处理方法简单、重现性好、灵敏度高等特点，为鉴定炭化竹席的真伪提供了技术支持。

竹席制品中染料的检测，有的按纺织品C类的要求进行[13]，禁用可分解致癌的芳香胺染料，并有相关的检测方法[14]《GB/T 17952-2011 纺织品禁用偶氮染料的测定》，但尚未见到竹席制品中罗丹明B检测方面的报道。目前市场上的“炭化竹席”大部分采用工业染料罗丹明B染制而成，以假乱真损害着经高温炭化处理工艺制成的炭化竹席的品牌信誉。炭化竹席中罗丹明B检测方法的建立，能达到区分目前市场上炭化竹席与染色竹席的目的。对保护消费者权益[15]，规范炭化竹席产业，保护环境具有重要意义。

[1] RD Hood. Comparative developmental toxicity of cationic and neutral rhodamines in mice [J]. Teratology，1989，40(2)：143-150.

[2] 中华人民共和国卫生部.食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)[R]http://www.gov.cn/gzdt/2008-12/15/ content _1178408.htm

[3] GB/T 30927-2014,化妆品中罗丹明B等4种禁用着色剂的测定 高效液相色谱法[S]. 北京：中国质检出版社，2014.

[4] 颜范勇，陈立功，闫喜龙, 等. 罗丹明类荧光染料的合成及应用[J]. 化学进展，2006，18(2/3)；252-261.

[5] 胡侠，肖光，潘炜，等. 高效液相色谱—串联质谱法同时测定辣椒粉及辣椒油中7种罗丹明染料[J]. 色谱，2010，28(6)：590-595.

[6] 程慧，李兵，占春瑞. 腊肠中罗丹明B的高效液相色谱串联质谱检测方法[J]. 食品科学，2010，31(4)：223-225.

[7] 王传现，韩丽，方晓明，等. 食品中罗丹明B的高效液相色谱荧光检测[J]. 分析仪器，2008，1：27-30.

[8] 周鹏，余清，林钦，等. 液质联用法测定辣椒红色素中罗丹明B的含量[J]. 食品研究与开发，2013，34(4)：74-76.

[9] SN/T 2430-2010,进出口食品中罗丹明B的检测方法[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[10] 李小平，潘胜东，赵永纲. 固相萃取-高效液相色谱荧光法同时测定辣椒面中的罗丹明B和罗丹明123[J]. 中国卫生检验杂志，2012，22(8)：1766-1769.

[11] 李小燕，李梅，陈其锋，等. 固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中的罗丹明B[J]. 食品科学，2011，32(8)：238-243.

[12] 吴忠心. 高效液相色谱法测定辣椒粉罗丹明B的不确定度评定[J]. 农产品加工，2013(4)：74-77.

[13] GB 18401-2010,国家纺织产品基本安全技术规范[S]. 北京：中国标准出版社，2011.

[14] GB/T 17592-2011,纺织品禁用偶氮染料的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2012.

[15] 文卫华，佘佳荣. 食用林产品质量安全问题与对策[J]. 湖南林业科技，2013，40(1)：104-107.

DeterminationofrhodamineBinthermo-modifiedbamboomatbyhighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetection

DUAN Junmin, SHE Jiarong, HUANG Li, HUANG Jun

(Hunan Quality Inspection and Testing Center for Forest Products, Changsha 410007, China)

Rhodamine B in samples were extracted with ethanol-water solution, separated on C18 reverse-phase chromatography column and detected by fluorescence detector. The results showed that, linear correlation coefficient was 0.9999, over the range of 0.1～200 μg/L. The recoveries were 806%～92.8% for spiked standards at 20，500，5000 μg/kg levels with RSD of 1.3%～2.1%(n=6)，and the detection limit was 5.0 μg/kg. The high performance liquid chromatography with fluorescence detection method has the advantages of simple，fast and accurate，is suitable for determination of rhodamine B in bamboo mat.

thermo-modified bamboo mat； rodamine B；HPLC； fluorescence detection

2015-05-12

段俊敏(1985-)女，湖南省益阳市人，硕士，主要从事分析化学、林产品质量安全检测工作。

O 657.7+2

A

1003 — 5710(2016)04 — 0054 — 07

10.3969/j.issn. 1003 — 5710.2016.04.012

(文字编校：杨 骏)