TGEV-PEDV二重RT-PCR检测方法的建立及应用

江　毅　杨佰雨　孔维欢　王大军　赵月龙　刘盼召　冉大鹏　赵浩　周刘涛　何　雷

(河南科技太学动物疫病与公共卫生重点实验室,河南洛阳　471003)

TGEV-PEDV二重RT-PCR检测方法的建立及应用

江毅杨佰雨孔维欢王大军赵月龙刘盼召冉大鹏赵浩周刘涛何雷*

(河南科技太学动物疫病与公共卫生重点实验室,河南洛阳471003)

本试验旨在建立能同时检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的二重RT-PCR检测方法.首先根据GenBank收录的TGEV和PEDV的基因序列,设计扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的特异性引物,然后通过优化二重PCR的体系建立一个二重RT-PCR检测方法.用该方法对临床收集的10份粪便样品进行检测,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特异性和灵敏度,能用于临床诊断及流行病学调查。

猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒多重PCR诊断

1　材料与方法

1.1试验材病毒与病料

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)细胞分离毒株和猪流行性腹泻病毒(PEDV)病料以及采集的疑似病毒性腹泻粪便样品.由河南科技大学预防兽医检疫实验室保存。

1.2单项PCR扩增cDNA

取200uL病毒液样品按照病毒RNA提取试剂盒分别提取TGEV和PEDV的病毒RNA.进行RT-PCR反应,退火温度分别为(PEDV 55℃,TGEV 57℃),引物序列为.随后将目的片段进行序列测定。

1.3多重PCR的建立

在单对引物扩增成功的基础上,将目的片段加入同一PCR反应体系中配制二重PCR反应混合液.退火温度分别为57℃.同时,对多重PCR反应体系的引物浓度、退火温度等进行优化。

1.4特异性试验

参照2.2方法分别对PRRSV、CSFV、PCV等,进行RNA和DNA的提取,以该系统所建立的PCR体系和引物通过RT-PCR和PCR扩增,同时设PEDV和TGEV细胞毒混合物为阳性对照,以检验该方法的特异性。

19周龄4个处理组鸡体重和胫长见表4。由表4可以看出，育成期不同的蛋白质水平对鸡体重和胫长造成的影响，在统一日粮后，饲喂5周，即蛋鸡在19周龄时各处理的体重和胫长已无显著差异（P＞0.05）。

1.5敏感性试验

将TGEV和PEDV细胞毒株混合物为阳性对照.调整核酸浓度,按l0倍以内的浓度梯度稀释,按优化的多重PCR反应体系进行PCR扩增。

1.6多重PCR方法的临床应用

取本实验室所采集的疑似病毒性腹泻粪便为样品,按照上述方法建立的多重PCR技术,检测TGEV和PEDV。

2　结果与分析

2.1TGEV-PEDV二重PCR检测体系的建立与优化

首先本研究通过对病料组织的RNA的提取,并通过RT-PCR的方法扩增了PEDV和TGEV基因片段.在上述研究的基础上,本研究以TGEV和PEDV的回收产物为模板,设计TGEV和PEDV特异性扩增引物进行了PCR扩展(图2),电泳结果表明,扩增产物符合预期目的片段,对其优化结果表明,最佳退火温度为57℃。

图1　TGEV-PEDV二重PCR凝胶电泳图

图2　TGEV-PEDV多重PCR的特异性试验检测结果

2.2特异性试验结果

分别对PRRSV、CSFV、PCV等进行了RNA和DNA的提取,以该系统所建立的多重PCR体系进行扩增,特异性实验结果表明,该PCR体系对PRRSV、CSFV、PCV均无扩增(图3),说明所建立的PCR体系特异性强。

2.3敏感性试验结果

将目的片段的核酸分别作稀释,使其浓度分别为100ng、50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng和0.1ng的总量,并以此作为扩增模板,结果表明,核酸量为100ng,50ng,10ng和5ng和1ng能扩增出特异性条带,而PEDV和TGEV的核酸为0.5ng的仅能扩增微弱的条带;的没有扩增条带.因此该PCR体系的灵敏性为0.1ng/uL。

2.4多重PCR临床检测初步应用

以建立的二重PCR方法检测采集的临床8份样品进行了检测,见图3,结果表明3份为PEDV阳性,2份为TGEV阳性,没有检测到混合感染的病例。

图3　多重PCR临床初步应用检测结果

3　讨论

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒感染是仔猪的常见疾病,发病率高,目前均没有有效的药物,且两者在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异.严重影响养猪业的健康发展.临床上此两种病往往混合感染.RT-PCR技术目前是鉴别诊断上述病毒病原的最敏感、特异的方法。

多重PCR技术在同一体系中实现多个目标基因的特异性扩增,但并非单一PCR简单混合.引物设计是其中一个关键因素.除了考虑每对引物的特异性及扩增效率之外.还必须尽量减少引物对之间形成二聚体的可能,此外,还须对各对引物浓度配比、退火温度及其他PCR反应条件进行优化.相对于传统PCR检测单一病原体,多重PCR能同时进行多种病原微生物的鉴定,且具有灵敏、快捷等特点,适于大规模检测,在动物疫病的流行病学的调查与预防中,具有不可替代的作用.本文针对TGEV和PEDV基因序列,扩增了2个特异性片段,长度分别为500bp和750bp目的片段之间具有明显的长度差异,便于鉴别,且单对引物的扩增特异性强,扩增效率高,为在兽医临床中PEDV和TGEV的实验室诊断提供了技术手段。

河南科技大学实验开发基金(SY1314047)和大学生研究训练计划(SRTP)项目(2014265)支持。

江毅(1995-),男,河南洛阳人,本科学历,主要研究方向:分子病原学和免疫学。

何雷(1983-),男,河南南阳人,博士学历,讲师,研究方向:分子病原学和免疫学。