不同转染试剂对大鼠原代间质细胞转染效率的比较分析

朱 玲　陈 强　龚金秋　曾 杰　胡 男　王水莲

（湖南农业大学，湖南长沙　410128）

不同转染试剂对大鼠原代间质细胞转染效率的比较分析

朱 玲陈 强龚金秋曾 杰胡 男王水莲

（湖南农业大学，湖南长沙410128）

目的:为了比较不同转染试剂的转染效率，本实验以大白鼠原代细胞为模型比较了两种不同转染试剂的效果。方法: 以pEGFP为报告基因，用两种转染试剂转染大鼠睾丸间质细胞，用荧光显微镜观察，分析两种转染试剂的转染效率。结果:在质粒为0.75μg和lipofectamine3000为0.75μl情况下，lipofectamine 3000转染效率最高（P＜0.05），lipofectamine 3000转染效率高于lipofectamine LTX。结论:与lipofectamine LTX相比，lipofectamine3000具有转染效率高、剂量低和操作方便的优点。

大鼠睾丸间质细胞转染EGFP

睾丸间质细胞成群分布在曲细精管的疏松结缔组织中。从青春期开始，睾丸间质细胞受垂体前叶嗜碱性细胞分泌的黄体生成素作用下能合成并分泌雄性激素。外源基因导入细胞常用转染的方法中应用较多的包括脂质体转染法、磷酸钙转染法和点穿孔法等。脂质体转染对于仪器试剂操作要求低，是针对一般细胞转染应用最多的转染方法。本研究以间质细胞为模型，用二种不同转染试剂进行转染，分析转染效率，可为研究间质细胞分泌睾酮的机制提供理论基础。

1　材料与方法

1.1试剂与动物

含GFP基因的PEGFP-N1质粒（由华中农业大学提供），opti-MEM、lipofectamine LTX和lipofectamine 3000试剂，胶原酶Ⅳ、DMEM高糖和四季青血清，3β-HSD染色液（实验室保存）。

实验动物：8周龄雄性SD大白鼠（湖南斯莱克景达动物有限公司）

1.2方法

1.2.1实验分组与处理

将大鼠睾丸间质细胞随机分组，即lipofectamine LTX转染组（添加质粒和lipofectamine LTX，用A表示）、lipofectamine 3000转染组（添加质粒和lipofectamine 3000，用B表示）。A组依质粒剂量与转染试剂lipofectamine LTX剂量分为A1组（0.8 μg：1 μl）、A2组（0.8 μg：2 μl）、A3组（0.8μg：3 μl）、A4组（1.0 μg：1 μl）、A5组（1.0 μg：2 μl）、A6组（1.0 μg：3 μl）、A7组（1.2 μg：1 μl）、A1组（1.2 μg：2 μl）、A1组（1.2 μg：3 μl），B组依质粒剂量转染试剂lipofectamine 3000剂量分为B1组（0.5 μg：0.75 μl）、B2组（0.75 μg：0.75 μl）、B3组（1.0 μg：0.75 μl）、B4组（0.5 μg：1.5 μl）、B5组（0.75μg：1.5 μl）、B6组（1.0 μg：1.5 μl）。

1.2.2间质细胞转染条件优化与效率的比较

（1）间质细胞提取传代

依照胶原酶浓度差异法[3］提取间质细胞培养，间质细胞传代2次，胰酶消化后以2×105个/孔的密度接种到24孔细胞培养板中，细胞密度达70%-80%时转染备用。

（2）试剂转染

Lipofectamine LTX试剂不同剂量的质粒溶解到50 μlopti-MEM中，加入1 uLlipofectamine Plus，各组不同剂量的lipofectamine LTX试剂溶解50 μlopti-MEM中，室温静置5 min，将两种溶液混合，室温静置25 min，加入到含有500 μl无血清和双抗的培养基的24孔板中，6 h后用含有血清培养基换液继续培养48 h后用倒置荧光显微镜照相并分析。同时，用lipofectamine 3000进行转染，各组质粒溶解到25 μlopti-MEM溶液中，加入1 μl P 3000，各组不同剂量lipofectamine 3000溶解于25 uLopti-MEM中，将两种溶液混合，室温静置5 min，加入到500 μl含有血清和双抗的培养基的24孔细胞培养板中，48 h后用倒置荧光显微镜照相与并分析。

2　结果与分析

2.1lipofectamine LTX与lipofectamine 3000转染睾丸间质细胞条件的优化

本研究结果表明lipofectamine LTX转染试剂中A5组转染效率最高，高于A6组和A8组转染效率且差异显著（P＜0.05），A2组高于A3组转染效率且差异显著（P＜0.05），A7组高于A9组转染效率且差异显著（P＜0.05），其他组别相比差异不显著（P＞0.05）（表1）。lipofectamine3000转染试剂中B2组转染效率最高，高于B3组和B5组转染效率且差异显著（P＜0.05），B1组高于B4组转染效率且差异显著（P＜0.05）（表2）。

表1 不同剂量pEGFP和lipofectamineLTX转染睾丸间质细胞后48 h的细胞转染效率（%）

表2 不同剂量pEGFP和lipofectamine3000转染睾丸间质细胞后48 h的细胞转染效率（%）

综上可知lipofectamine LTX在质粒1.0 ug，lipofectamine LTX 2 μl时转染效率最高lipofectamine 3000在质粒0.75 μg，lipofectamine3000 0.75 μl时转染效率最高。

2.2lipofectamine 3000与Lipofectamine LTX转染效率

图1和图2分别是lipofectamine 3000和lipofectamine LTX转染后的照片，图1的转染效率高于图2的转染效率。对睾丸间质细胞转染lipofectamine3000转染试剂比lipofectamine LTX转染试剂转染效率高且差异显著（P＜0.05）（表3）。

图1 （40×）lipofectamine 3000转染间质细胞

图2 （40×）lipofectamine LTX转染间质细胞

3　讨论

本研究是应用脂质体转染法比较转染试剂的转染效率，结果中发现，ipofectamine3000试剂进行转染时质粒0.75 μg和转染试剂0.75 μl时转染效率最高。但当DNA加入过量时，转染效率反而下降，结果与文章报道一致。这可能是因为过量的质粒DNA可以形成一个类聚集体会产生额外的阻力，从而影响转染水平，也可能是过量DNA会降低与带负电荷的物质相互竞争交换从LPP中解离出来的效率。

转染间质细胞时lipofectamine3000试剂在操作过程中不需要必须使用无血清培养基，在培养基中可以含有血清、双抗等，在转染6 h后无需再次换液直到48 h于荧光显微镜下进行观察，因此操作较其他转染试剂方便快捷，并且在转染效率方面要高于lipofectamine LTX。双抗对于细胞生长非常关键，有效抑制细菌生长，降低细胞污染概率。对于转染试剂的使用量增加转染效率反而降低的原因是由于转染试剂本身具有毒性，伴随转染试剂试剂量增加毒性也会增加。本试验中lipofectamine 3000的试剂和质粒使用量远远低于其他转染试剂的使用量，可减少阳离子脂质体对于细胞的毒性作用。lipofectamine 3000转染后细胞状态会良好，传代后细胞死亡少，细胞状态良好。蒋静思等研究表明，lipofectamine LTX转染效率明显高于lipofectamine 2000，本实验中lipofectamine 3000转染效率高于lipofectamine LTX转染效率且差异性显著。因此，在使用脂质体转染方法中lipofectamine 3000是更加适合转染大鼠睾丸间质细胞的试剂。

陈强（1990-），男，湖南农业大学硕士研究生，研究方向为临床兽医学。

朱琳（1994-），女，湖南农业大学本科生，研究方向为临床兽医学。

王水莲，湖南农业大学教授。