基于高密度细胞的快速发酵酒精技术可行性研究

徐日益，尚红岩，黄向阳，梁 磊，苏江滨，陈启球

（1广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广州　510316；2广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心，广州　510316；3广州市植物纤维综合利用重点实验室，广州　510316；4广东省

生物质高值化利用工程实验室，广州　510316；5广东徐闻三和发展有限公司，湛江　524132）

基于高密度细胞的快速发酵酒精技术可行性研究

徐日益1，2，3，4，尚红岩1，2，3，4，黄向阳1，2，3，4，梁 磊1，2，3，4，苏江滨1，2，3，4，陈启球5

（1广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广州510316；2广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心，广州510316；3广州市植物纤维综合利用重点实验室，广州510316；4广东省

生物质高值化利用工程实验室，广州510316；5广东徐闻三和发展有限公司，湛江524132）

将鲜酿酒酵母泥按不同的接种量接入糖蜜培养基进行发酵，研究表明随着接种量的增大，酵母增殖系数减少、发酵周期缩短、发酵率略微降低。经数据统计分析发现在一定范围内，初始细胞数和最终细胞数的平均值与发酵周期的乘积 K为常量，表明基于高密度细胞的糖蜜快速发酵酒精技术是一项可行并且十分有前景的技术。

高密度细胞；快速发酵；酒精

0　前言

目前南方糖蜜酒精企业多采用固定化酵母双浓度双流加发酵工艺生产酒精［1-2］，常规做法是将固定化酵母放置于种子罐内，流加15～20 °Bx的稀糖蜜作为培养基，罐内酵母浓度依据糖蜜质量的优劣程度可达0.8亿～1.5亿个/mL不等。近年来国家环保政策趋于严格，大部分糖厂的附属酒精车间被叫停生产，各个糖厂的糖蜜被统一集中处理，糖蜜酒精生产模式由车间榨季性生产转变为规模化常年连续生产。各种来源的糖蜜在运输过程中必然受到不同程度的污染，随后被集中储存在数千乃至上万立方米的大型储罐长达半年甚至2年之久。存储期间，蛋白质和还原糖发生美拉德反应产生氨基糖色素［3-4］；另外由于糖蜜黏度非常高，不易进行灭菌，因此耐高渗微生物可将部分可发酵性糖转化为有机酸，而这2类产物皆对酒精酵母产生很强的抑制作用，导致种子罐酵母细胞浓度处于1亿个/mL左右的低水平，从而使得整体发酵周期延长、生产效率低下。长期以来，学者对接种量和酒精发酵速度有普遍共识：接种量小，发酵周期长，出酒率相对高；接种量大，发酵周期短，出酒率相对低［5-7］，但是接种量和发酵周期具体有何种深层次的规律，至今鲜有报道。本文系统研究了酵母细胞浓度和发酵周期的关系，揭示了在一定范围内平均细胞数与发酵周期的乘积K为常量的规律，初步探索了高密度酿酒酵母细胞快速发酵酒精的可行性，为高浓糖蜜快速发酵酒精技术提供了理论基础。

1　材料与方法

1.1实验材料

酿酒酵母，由广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）保藏；

糖蜜，83.27 °Bx，由广东徐闻三和发展有限公司提供；

种子培养基：葡萄糖2%，酵母浸粉1.5%，蛋白胨2%，115℃、20 min蒸汽灭菌；

发酵培养基：30 °Bx糖蜜，pH 3.8，0.2%尿素，115℃、20 min蒸汽灭菌。

1.2主要实验仪器

MoxiZ细胞计数仪，美国ORFLO公司；PAL-α迷你数显折射仪，广州爱宕科学仪器有限公司；BS201S电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；TDL-5A离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1鲜酵母培养收集方法

无菌条件下，挑一环新鲜斜面菌苔至小三角瓶种子培养基中，30℃、100 r/min培养16～20 h，再按10%的接种量接种至大三角瓶种子培养基，30℃、100 r/min培养16～20 h，离心分离收集菌泥备用。

1.3.2细胞计数方法

鲜酵母泥经生理盐水稀释适当倍数后用MoxiZ细胞计数仪测量。由于脱水条件所限，经测1 g酵母泥含102亿个细胞；发酵液细胞数则是取0.1～0.5 mL，发酵液稀释适当倍数后用MoxiZ细胞计数仪测量。

1.3.3糖蜜发酵期间失重测量方法

精确称量0.05、0.1、0.5、1 g鲜酵母泥分别接种于100 mL糖蜜发酵培养基中，给三角瓶套上发酵栓，静止发酵，每隔2～6 h摇匀并测失重，直至失重速率≤0.02 g/（100mL·h）时发酵结束，记录发酵时间，绘制失重曲线。

1.3.4糖蜜发酵期间细胞数和锤度测量方法

精确称量0.05、0.1、0.5、1 g鲜酵母泥分别接种于100 mL糖蜜发酵培养基中，给三角瓶套上发酵栓，静止发酵，每隔2～6 h于无菌条件下取0.5 mL测细胞数和锤度，直至锤度不再下降时发酵结束，绘制细胞生长曲线和锤度曲线。

2　结果与讨论

2.1接种量对糖蜜发酵失重、糖耗及细胞生长的影响

如图1可知，随着接种量的增大，发酵时间缩短，失重速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接种量分别在第 68、58、31、20 h时失重速率≤0.02 g/（100mL·h）。如表1可知，随着接种量增大，最终发酵失重略微下降，0.05%、0.1%、0.5%、1%接种量发酵组的最终失重量依次为7.42、7.3、7.2、7.12 g，这是因为接种量大、细胞基数也就越多，用于维持细胞生命活动所消耗的能量就越多，所以用于转化为酒精的糖相应地减少，发酵率也略微下降。

如图2可知，随着接种量的增大，糖耗速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接种量发酵组分别在第68、58、31、20 h时锤度降到终点13 °Bx左右，这个时间点和失重停止的时间点是相互对应的，因为根据葡萄糖酒精代谢反应式，发酵失重量和酒精产量是成正比关系的。

如图3可知，随着接种量增大，细胞生长延滞期缩短，0.05%接种量发酵组延滞期长达 12 h，而1%接种量发酵组则直接进入对数生长期，0.05%、0.1%、0.5%、1%接种量发酵组进入平稳期的时间点依次为第40、32、16、8 h，结合图1发现这些时间点对应的失重都为4.3 g左右，间接反应了发酵液累积产生的酒精到达一定浓度后便抑制酵母繁殖，据测量失重4.3 g左右时对应的酒精浓度约为6%（v/v）。

图1　接种量对糖蜜发酵失重的影响

图2　接种量对糖蜜发酵液锤度的影响

图3　接种量对糖蜜发酵期间细胞生长的影响

2.2接种量对酵母细胞增量和增殖系数的影响

如表1所示，4组不同接种量发酵组的细胞增量处于0.706亿～0.734亿个/mL，近乎于相等，所以细胞增殖系数也就随接种量的增大而减少。酵母繁殖和发酵是同时进行的，初始阶段抑制酵母生长的因素只有渗透压，随着发酵代谢活动的进行，产生的酒精累积到一定浓度便可抑制酵母生长，此后阶段酵母只能进行发酵而不能繁殖。由此可知接种量大的发酵液组累积产生的酒精较先达到酵母生长抑制浓度，与此同时接种量小的发酵液组还在继续增殖，直至发酵酒分累积至细胞生长抑制浓度，综合细胞繁殖时间和细胞基数两者对细胞增量的相互作用效果，推测各组的细胞增量可接近同一值。

表1　不同接种量发酵液组的发酵参数

2.3平均酵母数和发酵周期的关系

如表1所示，经统计初始、最终细胞数、发酵周期各组数据，进一步观察发现4组接种量发酵组的平均酵母数和发酵周期的乘积K处于27～28，考虑计数误差，K值可视作为常量，说明平均酵母数和发酵周期成反比关系，随着接种量增大，平均酵母数也增大，发酵周期则相应地缩短，K值常量与此现象是吻合的，此发现国内文献鲜有报道。

3　结论与探讨

目前国内糖蜜酒精连续发酵一般有5～10级，种子罐兼作酵母培养罐和前发酵罐，酵母浓度 0.8亿～1.5亿个/mL，酒度4%～6%（v/v），后发酵罐经过高浓糖蜜冲稀后酵母浓度只有 0.5亿～1亿个/mL，一般种子罐发酵时间10 h，后发酵时间30～40 h。高密度细胞培养技术现在已经非常成熟，笔者常年与广东梅山—马利酵母有限公司、广东丹宝利酵母有限公司、广西湘桂酵母科技有限公司合作，据了解采用高密度细胞培养技术时细胞湿重可达到150～200 g/L发酵液，细胞浓度可以达到20亿～30亿个/mL，如果采用高密度细胞发酵，根据 K值理论发酵周期可缩短至10 h以内，也就是说只需配备2～3个发酵罐，可大大减少设备和场地投资费用，高密度细胞快速发酵亦可大幅增加酒精产能，是一项非常有市场前景的生物技术。

［1］陈学鹏. 固定化酵母在（糖蜜）酒精连续发酵生产中的应用［J］. 酿酒科技，2001（2）：43-44.

［2］徐日益，梁磊，尚红岩，等. 糖蜜酒精发酵过程酵母结团及低酒分解决措施［J］. 甘蔗糖业，2009（4）：38-39.

［3］吴振强，梁世中. 糖蜜酒精蒸馏废液色素研究［J］. 环境污染与防治，2002，24（1）：13-15.

［4］王湘茹，于淑娟. 甘蔗糖蜜澄清处理及处理前后组分分析［J］. 中国调味品，2010，35（2）：64-68.

［5］陈雪，甄玉国，赵小丽. 以糖蜜为碳源对酿酒酵母发酵条件的优化［J］. 中国饲料，2015（6）：14-16.

［6］梁磊，张远平，浦跃武，等. 高酵母接种量的抑菌特性及其在蔗汁生产乙醇中的应用［J］. 食品与发酵工业，2007，33（12）：1-3.

［7］张锋，刘钺，李勇，等. 不同接种量对酒精发酵的影响浅析［J］. 创新科技，2014（20）：84-85.

（本篇责任编校：邓丹丹）

Feasibility Study on Rapid Fermentation Technology Based on High Cell Concentration

XU Ri-yi1，2，3，4， SHANG Hong-yan1，2，3，4， HUANG Xiang-yang1，2，3，4， LIANG Lei1，2，3，4， SU Jiang-bing1，2，3，4，CHEN Qi-qiu5
（1Guangdong Provincial Bioengineering Institute （Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute）/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery， Guangzhou 510316；2Guangdong Engineering Research & Development Center for Comprehensive Utilization of Plant Fiber， Guangzhou 510316；3Guangzhou Key Laboratory for Comprehensive Utilization of Plant Fiber， Guangzhou 510316；4Guangdong Provincial Engineering Laboratory of Biomass High Value Utilization， Guangzhou 510316；5Guangdong Xuwen Sanhe Development Co. Ltd.， Zhanjiang 524132）

Various quantities of fresh yeast cells were inoculated in molasses medium to ferment alcohol. The results suggested that with inoculum concentration increasing， the cell proliferation rate， fermentation period and distillation yield decreased. Further analysis showed the product of fermentation period and mean cell numbers which were calculated by initial cell numbers and final cell numbers was constant within limits， which indicated that the rapid fermentation technology based on high cell concentration was feasible and promising.

High cell concentration；Rapid fermentation；Alcohol

TS249.3

A

1005-9695（2016）05-0029-04

2016-06-22；

2016-10-09

广东省省级科技计划项目（2013B010102002、2014A010107017、2016B070701005）；广东省科学院科研平台环境与能力建设专项资金项目（2016GDASPT-0208）

徐日益（1984-），男，江西人，工学硕士，高级工程师，研究方向：发酵工程

引文格式：徐日益，尚红岩，黄向阳，等. 基于高密度细胞的快速发酵酒精技术可行性研究［J］. 甘蔗糖业，2016（5）：29-32.