不同精粗比饲粮中添加甘露寡糖对绵羊体外瘤胃发酵的影响

陈志龙　曾燕霞　王　林　赵　臣　郑　琛

(甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州730070)



不同精粗比饲粮中添加甘露寡糖对绵羊体外瘤胃发酵的影响

陈志龙曾燕霞王林赵臣郑琛*

(甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州730070)

本试验旨在研究不同精粗比饲粮中添加甘露寡糖(MOS)对绵羊体外瘤胃发酵的影响。采用4×6二因子析因试验设计，在4种不同精粗比(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50)饲粮中分别添加6个水平(0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)的MOS，制备出24种底物，以体外产气法对各底物培养3、6、9、12和24 h，对体外培养液pH、氨态氮(NH3-N)浓度和挥发性脂肪酸(VFA)浓度进行测定。结果表明：精粗比对培养液pH、NH3-N浓度、总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度和丁酸含量产生了显著影响(P<0.05)，MOS水平对培养液NH3-N浓度产生了显著影响(P<0.05)，精粗比与MOS水平对培养液NH3-N浓度产生显著的交互作用(P<0.05)。随着精粗比的提高，培养液TVFA浓度和丁酸含量升高，而pH和NH3-N浓度降低；随着MOS水平升高，培养液NH3-N浓度略有升高。综合得出，不同精粗比饲粮中添加MOS对绵羊体外瘤胃发酵NH3-N浓度有显著影响，其中MOS的影响较轻微，尚未呈现剂量效应，主体起作用的仍是精粗比；饲粮精粗比的提高增加了绵羊体外瘤胃发酵VFA浓度，降低了pH和NH3-N浓度。

精粗比；甘露寡糖；绵羊；pH；挥发性脂肪酸；氨态氮

功能性寡糖无论在体内还是体外都能促进有益菌群如双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，改善肠道微生态环境[1]。甘露寡糖(mannanoligosaccharides，MOS)因其具有稳定、安全无毒、无残留等特点以及改善肠道菌群、提高免疫力等益生作用成为功能性寡糖应用较为广泛的一种[2-6]。曾有报道认为，因为反刍动物瘤胃微生物对寡糖的强烈降解作用以及可以利用纤维素、半纤维素、果胶等物质合成寡糖，所以对反刍动物添加寡糖意义不大[7]。而且由于寡糖可以改善动物胃肠道内环境，对幼龄反刍动物如腹泻等胃肠道疾病具有良好的缓解及预防作用，以及寡糖可通过幼龄反刍动物尚不健全的瘤胃到达肠道发挥其益生作用等一系列原因，使寡糖有限的研究也集中在幼龄反刍动物上[8]。事实上，无论瘤胃微生物对寡糖有多大降解作用，反刍动物瘤胃中仍然有一定水平的寡糖发挥其益生作用，寡糖对反刍动物瘤胃发酵也具有重要的调控作用[9]。

饲粮结构如精粗比以及饲粮类型的不同会导致瘤胃微生物环境如pH、瘤胃微生物区系等的改变，从而改变其对寡糖的发酵效率，可能会与MOS产生一定的交互作用，因此本试验选用西北地区绵羊饲养中常用的饲草料并固定饲粮组成，通过体外培养的方法，探讨不同精粗比饲粮条件下MOS对绵羊体外瘤胃发酵的作用，为MOS在反刍动物上的进一步研究提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

MOS购自奥特奇生物制品(中国)有限公司。

1.2试验设计

试验采用4×6二因子析因试验设计，设精粗比(A)和MOS(B)2个因子，饲粮精粗比分别为20∶80(A1)、30∶70(A2)、40∶60(A3)及50∶50(A4)，在每个精粗比饲粮中分别添加6个水平的MOS，即0(B1)、0.4%(B2)、0.8%(B3)、1.2%(B4)、1.6%(B5)和2.0%(B6)，共制成24种底物进行体外瘤胃发酵试验。

1.3试验动物及饲养管理

1.4试验饲粮

参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)中育成公羊营养需要量(体重30 kg，日增重100 g)，配制4个不同精粗比的饲粮，以此为发酵底物。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1　试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of diets:S 200 mg,Fe 25 mg,Zn 40 mg,Cu 8 mg,I 0.3 mg, Mn 40 mg, Se 0.2 mg, Co 0.1 mg，VA 940 IU,VE 20 IU。

2)计算值 Calculated values。

1.5体外产气试验

试验参照Menke等[10]推荐的方法进行体外产气试验。

晨饲(08:00)前在4只绵羊瘤胃内不同位点采集足量瘤胃液，经4层纱布过滤饲料颗粒后灌入已经预热达39 ℃并通有CO2的暖瓶中，待采集足量瘤胃液后立即盖严瓶口，迅速返回实验室，持续通入CO2气体5 min，然后迅速与缓冲液以1∶2的比例制成混合液。在已加好样品(取样量0.2 g左右)和MOS的玻璃注射器(德国Haeberle)中加混合液30 mL，并排尽注射器内的气体，放入已预热(39 ℃)的恒温振荡水浴箱中培养3、6、9、12和24 h。每个水浴箱设置2个空白对照(100 mL玻璃注射器只加入30 mL混合液)。每个样品每个时间点做3个重复。

1.6测定指标

1.6.1培养液pH

各时间段培养结束后，将消化液及残渣完全转入至100 mL的塑料离心管中，立即采用高精度酸度计(PB-10，德国Sartorius)测定培养液pH。

1.6.2培养液氨态氮(NH3-N)浓度

将测定pH后的塑料离心管3 000 r/min离心15 min，离心后采集上清液并存储在-20 ℃冰箱待测。NH3-N浓度参照冯宗慈等[11]改进的比色法使用分光光度计测定，培养液取样量为0.2 mL。本试验测得的标准曲线为：

Y=1.767 6X-0.027 6(R2=0.997 9)。

式中：Y为NH3-N质量(mg)；X为吸光度值。

根据曲线得到的质量换算为浓度。

1.6.3培养液挥发性脂肪酸(VFA)浓度

使用Aglient 6890N型气相色谱仪测定VFA浓度。色谱柱为HP 19091N-213毛细管柱(美国Aglient)。色谱条件为：进样口温度200 ℃，N2流量2.0 mL/min，分流比40∶1，程序升温模式(120 ℃ 3 min，然后10 ℃/min至180 ℃，保持1 min)，火焰离子检测器(FID)温度250 ℃，FID空气、H2和尾吹气(N2)流量分别为450、40和45 mL/min。

1.7数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行二因子方差分析，差异显著时，采用Tukey法(方差齐)或Tamhane法(方差不齐)进行多重比较。以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2　结果与分析

2.1不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液pH的影响

从表2可以看出，随精粗比的增加，除了3 h外各时间点的pH逐渐降低，精粗比对培养液pH产生了显著影响(P<0.05)；MOS水平对体外培养液pH未产生显著影响(P<0.05)；精粗比与MOS水平也没有对培养液pH产生显著交互作用(P>0.05)。培养3 h，A2组培养液pH显著高于A4组(P<0.05)；培养6和9 h，A4组培养液pH显著低于其余3组(P<0.05)；培养12和24 h，A1组培养液pH显著高于其余3组(P<0.05)，且在培养24 h时A2和A3组培养液pH也显著高于A4组(P<0.05)。

表2　不同时间点体外培养液pH

续表2精粗比C/RMOS水平MOSlevel时间Time/h369122450∶50(A4)0(B1)6．467．157．267．167．150．4%(B2)6．797．167．327．177．120．8%(B3)6．707．207．267．127．181．2%(B4)6．487．157．237．147．211．6%(B5)6．457．217．257．167．252．0%(B6)6．647．177．287．117．16精粗比C/R20∶80(A1)6．74ab7．30a7．36a7．28a7．40a30∶70(A2)6．83a7．21a7．35a7．18b7．33b40∶60(A3)6．66ab7．22a7．36a7．18b7．28b50∶50(A4)6．59b7．19b7．27b7．14b7．18cMOS水平MOSlevel0(B1)6．687．227．317．237．290．4%(B2)6．747．267．327．217．280．8%(B3)6．777．237．317．207．321．2%(B4)6．657．237．317．187．311．6%(B5)6．677．207．337．217．312．0%(B6)6．717．237．307．167．26SEM0．020．010．010．010．01P值P⁃value精粗比C/R0．002<0．001<0．001<0．0010．036MOS水平MOSlevel0．5640．0550．0630．0920．591精粗比×MOS水平C/R×MOSlevel0．0900．0620．0541．0000．375

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液NH3-N浓度的影响

从表3可以看出，精粗比、MOS水平及二者交互作用对各时间点培养液中NH3-N浓度均产生了显著的影响(P<0.05)。培养3 h，A2组培养液中NH3-N浓度显著高于A1组(P<0.05)；培养6 h，A1组培养液中NH3-N浓度显著高于其余3组(P<0.05)，A2组显著高于A3和A4组(P<0.05)，B3组培养液中NH3-N浓度显著高于B5组(P<0.05)；培养9 h，B2、B3和B5组培养液中NH3-N浓度显著高于B4组(P<0.05)；培养12 h，A1组培养液中NH3-N浓度显著高于其余3组(P<0.05)，A3、A4组显著高于A2组(P<0.05)，B5和B6组显著高于B3组(P<0.05)；培养24 h，A3组培养液中NH3-N浓度显著低于其余3组(P<0.05)，B5和B6组显著高于B2和B4组(P<0.05)，B1组显著高于B2组(P<0.05)。

2.3不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液VFA浓度的影响

从表4可以看出，精粗比对培养液中总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度和丁酸含量产生了显著影响(P<0.05)，MOS水平对培养液中TVFA浓度和各VFA含量未产生显著影响(P>0.05)，精粗比与MOS水平也没有对培养液中TVFA浓度和各VFA含量产生显著交互作用(P>0.05)。随精粗比提高，TVFA浓度和丁酸含量升高。A1组培养液中TVFA浓度显著低于其余3组(P<0.05)，且丁酸含量显著低于A4组(P<0.05)。

表3　不同时间点体外培养液中NH3-N浓度

表4　体外培养液中TVFA浓度及各种VFA含量

3　讨　论

3.1不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液pH的影响

瘤胃液pH是反映瘤胃内环境的一个重要生理指标，能直观反映瘤胃发酵是否正常，pH过高或过低对于正常的瘤胃微生物的生长、增殖及瘤胃发酵均不利[12]。瘤胃内pH维持在一个正常的范围是保证瘤胃正常发酵的前提。本试验中，各组体外培养液pH变动范围为6.45～7.45，均在瘤胃液pH的正常变化范围(5.5～7.5)内变化[13]。本试验中，精粗比对各时间点体外培养液中pH都产生了显著影响，且pH随精粗比的提高而降低。这是由于精粗比提高时，非结构性碳水化合物的比例也随之上升，发酵产物累积，从而产生更多的VFA使pH降低。MOS水平在各时间点对培养液pH没有产生显著影响，与肖宇等[14]的结果，即MOS显著降低奶山羊瘤胃液pH的结果不一致。这可能是由于本试验中MOS的添加水平较低(最高2.0%，0.04 g左右)，致使MOS的作用不明显；也可能是因为体外培养不能完全模拟体内环境，没有瘤胃上皮细胞对VFA的吸收作用而使pH变化不明显。

3.2不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液NH3-N浓度的影响

NH3-N是瘤胃代谢中含氮物降解的产物，也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的主要氮源，一定程度上可以反映出瘤胃微生物分解含氮物质产生NH3-N及对其摄取利用的情况，是瘤胃内环境的重要指标。如果NH3-N浓度过高，则说明瘤胃微生物降解氮源释放氨的速率超过了微生物利用其合成自身蛋白质的速率，这会增加瘤胃氮循环中氮素的损失，而NH3-N浓度过低会限制纤维素分解菌分解纤维素的效率[15]。NH3-N作为菌体蛋白合成的氮源,其最适浓度各国学者比较一致的看法是10～50 mg/dL[16]，而要保证动物的最高采食量和消化率，瘤胃内NH3-N的浓度应不低于20 mg/dL。本试验中，体外培养液中NH3-N浓度在25.58～131.57 mg/dL之间变动，较反刍动物瘤胃内正常NH3-N浓度高，这可能是由于体外培养中发酵产物与代谢终产物无法移出且没有反刍动物瘤胃壁可以吸收氨的缘故，导致氨在培养液中积累。整个培养期，培养液中NH3-N浓度随饲粮精粗比升高而降低，这可能是由于精饲料比例升高时易降解能源物质含量升高，促进瘤胃微生物增殖而加速培养液中NH3-N的消耗，促进菌体蛋白的合成[6]。MOS水平也对整个培养期体外培养液中NH3-N浓度产生了显著的影响，但并未表现出规律性的变化，仅在培养后期呈现出NH3-N浓度随MOS添加水平升高而略有升高。这可能是由于MOS对瘤胃微生物的促增殖作用较为缓慢，试验初期作用不明显，而在培养后期，随着MOS作用的逐渐呈现，使培养液中NH3-N浓度随MOS添加水平升高而略有增加。此外，体外发酵毕竟不能完全模拟体内环境，尤其是随着发酵时间延长、产物积累及pH降低均对微生物的发酵产生不利影响，因此，体外培养液中NH3-N浓度并未表现出非常规律性的变化。

3.3不同精粗比饲粮中添加MOS对体外培养液TVFA浓度和VFA含量的影响

VFA是反刍动物瘤胃中碳水化合物发酵的主要产物，也是反刍动物最主要的能量来源，用于合成体脂肪、乳脂肪等或者转化成其他物质提供能量[17]。由于VFA主要来源于微生物对碳水化合物的发酵，所以瘤胃发酵类型及VFA产量主要与饲粮的类型密切相关[18]。本试验中，A1组培养液TVFA浓度显著低于其余3组，是由于精饲料中非纤维性碳水化合物含量更高，能够快速完全地降解从而使TVFA浓度上升，这也与本试验中随精粗比提高pH降低的结果相对应。本试验中乙酸、丙酸含量及乙酸/丙酸变化不明显，可能是由于发酵底物较少，导致仅在VFA发酵总量上出现差异而不能显著影响到各种脂肪酸的含量，也有可能是在体外研究条件下，瘤胃微生物发酵产生的VFA不能像体内一样，被瘤胃壁和网胃壁等吸收，从而使乙酸和丙酸等单个脂肪酸的含量变化不明显。肖宇等[14]报道，外源添加功能性寡糖可以增加奶山羊瘤胃中乙酸和TVFA浓度；而Mwenya等[19]报道饲粮中添加异麦芽寡糖对绵羊瘤胃中VFA含量均不产生显著影响。本试验中MOS对体外培养液中TVFA浓度、乙酸/丙酸及各种酸的含量没有产生显著的影响，可能是因为MOS的添加水平较低(最高0.04 g/kg)导致其作用不明显，因此对于MOS在反刍动物上的适宜添加水平以及添加方式还需进一步研究。

4　结　论

① 不同精粗比饲粮中添加MOS对绵羊体外瘤胃发酵NH3-N浓度有显著影响，其中MOS的影响较轻微，尚未呈现剂量效应，主体起作用的仍是精粗比。

② 饲粮精粗比的提高增加了绵羊体外瘤胃发酵VFA浓度，降低了pH和NH3-N浓度。

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(责任编辑王智航)

Effects of Mannanoligosaccharides Supplementation in Diets with Different Concentrate to Roughage Ratios oninVitroRuminal Fermentation of Sheep

CHEN ZhilongZENG YanxiaWANG LinZHAO ChenZHENG Chen*

(College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The purpose of this study was to investigate the effects of mannanoligosaccharides (MOS) supplementation in diets with different concentrate to roughage ratios oninvitroruminal fermentation of sheep. Six levels (0, 0.4%, 0.8%, 1.2%, 1.6% and 2.0%) of MOS were supplemented in diets with four concentrate to roughage ratios (20∶80, 30∶70, 40∶60 and 50∶50) to formulate 24 kinds of subtract using a 4×6 two factorial experiment design. The subtracts were cultured for 3, 6, 9, 12 and 24 h usinginvitrogas production method, respectively, and pH, ammonia nitrogen (NH3-N) and volatile fatty acid (VFA) concentrations in cultivated fluid were determined. The results showed as follows: the pH, NH3-N concentration, total VFA concentration and butyrate content in cultivated fluid were significantly affected by concentrate to roughage ratio (P<0.05), NH3-N concentration was significantly influenced by MOS level (P<0.05), and NH3-N concentration was also significantly influenced by the interaction between MOS level and concentrate to roughage ratio (P<0.05). With the increase of concentrate to roughage ratio, total VFA concentration and butyrate content in cultivated fluid tended to be increased, while the pH and NH3-N concentration in cultivated fluid tended to be decreased; with the increase of MOS level, NH3-N concentration in cultivated fluid was slightly increased. In conclusion, MOS supplementation in diets with different concentrate to roughage ratios can significantly affect NH3-N concentration ofinvitrofermentation of sheep, the effect of MOS is slightly, and the main influencing factor still is concentrate to roughage ratio; the increase of concentrate to roughage ratio increases VFA concentration, but decreases pH and NH3-N concentration ofinvitrofermentation of sheep.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3292-3300]

concentrate to roughage ratio; mannamoligosaccharides; sheep; pH; volatile fatty acid; ammonia nitrogen

, associate professor, E-mail: zhengc@gsau.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.033

2016-04-08

国家自然科学基金(31560646)

陈志龙(1992—)，男，甘肃天水人，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail： judy.happy@outlook.com

郑琛，副教授，硕士生导师，E-mail: zhengc@gsau.edu.cn

S826;S816.7

A

1006-267X(2016)10-3292-09