分散固相萃取-HPLC及UPLC-MS/MS法测定豆干和调味品中的二甲基黄和二乙基黄

林子豪，周庆琼，曾 羲，郑春浩，黄思铭，欧阳钢锋，戚 平，*

（1.广州市食品检验所，广东 广州 510410；2.中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275）

分散固相萃取-HPLC及UPLC-MS/MS法测定豆干和调味品中的二甲基黄和二乙基黄

林子豪1，2，周庆琼1，曾 羲1，郑春浩1，黄思铭2，欧阳钢锋2，戚 平1，*

（1.广州市食品检验所，广东 广州 510410；2.中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275）

建立豆干和调味品中二甲基黄、二乙基黄的高效液相色谱初步筛查方法和超高效液相色谱-串联质谱确证方法。量品用酸化乙腈提取，经旋转蒸发浓缩和分散固相萃取净化后，采用高效液相色谱仪进行筛查，遇到阳性量品时，结合超高效液相色谱-串联质谱法进行确证分析，并对方法的有效性进行验证。结果表明，在高、中、低3 个水平进行加标回收实验，高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法回收率分别在92.2%～102.6%和84.7%～110.7%之间，相对标准偏差分别为0.14%～6.71%和0.16%～6.43%。高效液相色谱法成本较低、操作简单，适用于量品的筛查工作；超高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、定性准确性强，适用于阳性量品的确证。

二甲基黄；二乙基黄；高效液相色谱法；超高效液相色谱-串联质谱法；豆干；调味品

林子豪， 周庆琼， 曾羲， 等. 分散固相萃取-HPLC及UPLC-MS/MS法测定豆干和调味品中的二甲基黄和二乙基黄［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 217-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608039. http://www.spkx.net.cn

LIN Zihao， ZHOU Qingqiong， ZENG Xi， et al. Determination of dimethyl yellow and diethyl yellow in dried beancurd and condiment using dispersive solid-phase extraction and HPLC with diode array detector and UPLC-MS/MS［J］. Food Science， 2016，37（8）: 217-221. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608039. http://www.spkx.net.cn

二甲基黄和二乙基黄均为偶氮类脂溶性工业染料（图1），染色效果优异，成本低廉，常用于纺织品、木制品及陶瓷制品等工业产品的染色。但这两种染料都有致癌、致畸、致突变性，根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》规定，它们均不得在食品中使用。然而，一些不法商户为了牟取利益，将其用作食品着色剂。2014年，香港食物环境卫生署和台湾食药署先后公布在多个品牌的豆干中检出二甲基黄和二乙基黄，再次给食品安全问题敲响了警钟。

图1　二甲基黄（A）和二乙基黄（B）结构式Fig.1 Structures of dimethyl yellow （A） and diethyl yellow （B）

违禁色素的检测方法包括薄层色谱法［1-2］、高效液相色谱法［3-8］、气相色谱-串联质谱法［9］和液相色谱-串联质谱法［10-19］，应用较多的是液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。液相色谱法检测成本较低，但灵敏度较低，定性准确性较差，一般用于量品的筛查工作。液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高，定性准确性强，但是设备昂贵，适用于阳性量品的确证。

分散固相萃取是在提取液中直接加入萃取吸附剂进行净化，可有效除去量品中的杂质。与传统的液液萃取法及固相萃取法相比，分散固相萃取法在提取过程中受到的损失更少，操作简单、快速，广泛应用于农药残留［20-22］和兽药残留［23-25］的检测当中。范素芳等［10］采用改进的QuEChERS（quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）方法测定腐竹和豆干中的二甲基黄和二乙基黄，但回收率仅为70.5%～84.5%。本实验通过优化前处理条件，量同时建立高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法，对豆干和调味品中的二甲基黄和二乙基黄同时进行检测，达到更理想的回收率水平。在日常筛查工作中，先采用高效液相色谱法进行筛查，阳性量品再用超高效液相色谱-串联质谱法进行进一步确证。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

二甲基黄（纯度99.5%）、二乙基黄（纯度99.0%）德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯） 美国Thermo Fisher Scientific公司；盐酸（分析纯） 广州市化学试剂厂；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18） 北京振翔公司。

1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；LC-30超高效液相色谱仪 日本岛津公司；Q-TRAP 4000质谱仪（配电喷雾离子源） 美国AB公司；TDL-5-A离心机上海安亭科学仪器厂；RV 10旋转蒸发仪 德国IKA公司；旋涡振荡混合器 美国Thermo公司。

1.2方法

1.2.1标准工作液的配制

准确称取二甲基黄、二乙基黄标准品10.0 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用乙腈配制成1.0 g/L的标准储备液。根据需要用乙腈稀释成适当质量浓度的混合标准工作液，置于4 ℃条件下保存。

1.2.2量品提取

准确称取1.00 g均匀试量于50 mL离心管中，加入10 mL酸化乙腈（V（盐酸）∶V（乙腈）=1∶100）提取溶液，于旋涡混合器涡旋2 min，以4 500 r/min离心5 min，将上清液转移至梨形瓶中；量品再加入10 mL提取溶液重复提取一次，合并上清液。于旋转蒸发仪在35 ℃水浴中减压蒸发至干，用5 mL乙腈溶解残渣。

1.2.3净化

准确移取1 mL量品溶液于2 mL离心管中，再加入100 mg C18分散固相萃取吸附剂，旋涡混匀1 min，以10 000 r/min离心1 min，上清液过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜待测。

1.2.4分析方法

1.2.4.1高效液相色谱法条件

色谱柱：ZORBAX XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：35 ℃；进量量：10 μL；二极管阵列检测器检测波长：415 nm；流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：乙腈；流速：1.0 mL/min；洗脱条件：0～5.0 min，20% ～5% A；5.0～6.3 min，5.0% A；6.3～7.0 min，5%～20% A；7.0～10.5 min，20% A。

1.2.4.2超高效液相色谱-串联质谱法条件

色谱柱：Extend-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 µm）；柱温：40 ℃；进量量：10 μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液；流速：0.5 mL/min；洗脱条件：0～3.0 min，80%～95% A；3.0～4.0 min，95.0% A；4.0～4.2 min，95%～80% A；4.2～9.2 min，80% A。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；多反应监测模式；气帘气流速：20 L/min；雾化气流速：40 L/min；辅助加热气流速：40 L/min；碰撞气：高强度；电喷雾离子源温度：300 ℃；喷雾电压：5 500 V。

2　结果与分析

2.1提取溶剂的优化

范素芳等［10］使用乙腈作为提取溶剂，但回收率仅为70.5%～84.5%。在酸性条件下，二甲基黄和二乙基黄形成酸式盐（图2），更易于从量品中提取出来。本实验考察了不同盐酸配比乙腈提取液的提取效果，结果如图3所示。结果表明，在V（盐酸）∶V（乙腈）配比为1∶100时提取效果最佳。最终，本实验选择V（盐酸）∶V（乙腈）= 1∶100的酸化乙腈作为提取溶剂。

图2　二甲基黄（A）和二乙基黄（B）酸式盐结构转化图Fig.2 Acid salt structure transformation of dimethyl yellow and diethyl yellow

图3　不同盐酸-乙腈配比提取液二甲基黄和二乙基黄的提取效果Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the extraction efficiency of dimethyl yellow and diethyl yellow

2.2分散固相萃取净化

食品中常含有油脂、天然色素等杂质，容易对色谱柱造成污染，因此需要对量品提取液进行净化。分散固相萃取是一种常用的净化方法，常使用C18、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）等作为吸附剂。本实验比较了C18与GCB的净化效果，其中C18用量为25 mg，GCB用量为10 mg。结果表明，使用C18作为吸附剂二甲基黄和二乙基黄回收率均满足要求，使用GCB回收率均低于20%。由于二甲基黄和二乙基黄结构中均带有苯环结构，容易被GCB吸附。因此本实验选择C18作为吸附剂进行净化。

2.3检测波长的选择

图4　二甲基黄（A）和二乙基黄（B）最大吸收波长Fig.4 Maximum absorption wavelengths of dimethyl yellow （A） and diethyl yellow （B）

二甲基黄的最大吸收波长为410 nm，二乙基黄的最大吸收波长为420 nm（图4），二者均属于可见光区域，干扰相对较少。综合二者，选择415 nm作为检测波长。

2.4质谱条件的优化

在电喷雾例子模式下分别对1.0 mg/L的二甲基黄和二乙基黄单标溶液进行一级质谱分析，得到准分子离子峰［M+H］+。对准分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，并对其碰撞能量进行了优化（表1）。

表1　二甲基黄、二乙基黄的质谱检测参数Table 1 MS parameters of dimethyl yellow and diethyl yellow

2.5超高效液相色谱-串联质谱确证

图5　二甲基黄和二乙基黄的色谱分离图Fig.5 Chromatographic separation of dimethyl yellow and diethyl yellow detected by HPLC

在量品筛查过程中若检出二甲基黄或者二乙基黄（图5），可采用超高效液相色谱-串联质谱进行进一步确证分析。当出现二甲基黄和二乙基黄的特征离子对（表1）并且相对丰度在允许变化范围内时，可以判定检出二甲基黄或二乙基黄。图6为质量浓度为1.0 ng/mL二甲基黄和二乙基黄的总离子流图及提取离子流图。

图6　二甲基黄和二乙基黄谱图Fig.6 Chromatograms of dimethyl yellow and diethyl yellow

2.6线性范围及检出限、定量限

对于高效液相色谱方法，配制0.1～2.5 mg/L的标准曲线；对于超高效液相色谱-串联质谱方法，分别在豆干和辣椒粉空白提取液中准确添加适量的标准溶液，配制成1.0～25.0 µg/L的标准曲线，酱料采用溶剂标准曲线，按相应仪器工作条件测定。以峰面积（y）对质量浓度（x）作校正曲线，得到线性范围、线性回归方程及相关系数（r）如表2、3所示。以3 倍信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限，分别计算出二甲基黄和二乙基黄的检出限和定量限，两者一致，检出限和定量限分别为1.7、5.0 µg/kg。

表2　两种染料的高效液相色谱线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Linear ranges， regression equations， correlation coefficients，LODs and LOQs of HPLC for the two dyes

表3　两种染料的超高效液相色谱-串联质谱线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear ranges， regression equations， correlation coefficients，LODs and LOQs of UPLC-MS/MS for the two dyes

2.7加标回收测定实验结果

按照实验测定步骤，采用豆干、酱料、辣椒粉空白量品，分别采用高效液相色谱和超高效液相色谱-串联质谱进行高、中、低3 个水平进行加标回收实验，每个水平重复测定6 次，结果如表4所示。在不同加标水平条件下，二甲基黄和二乙基黄高效液相色谱测定回收率为92.2%～102.6%，相对标准偏差为0.14%～6.71%；超高效液相色谱-串联质谱回收率为84.7%～110.7%，相对标准偏差为0.16%～6.43%，表明2 种方法均具有良好的精确度和精密度，满足日常检测分析的需求。

表4　两种染料不同样品回收率及相对标准偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of the two dyes in different samples

3　结 论

本实验以酸化乙腈（V（盐酸）∶V（乙腈）=1∶100）为提取溶剂，结合分散固相萃取技术，采用C18进行净化，同时建立了豆干和调味品中二甲基黄、二乙基黄的高效液相色谱和超高效液相色谱-串联质谱方法。在日常筛查工作中，先通过高效液相色谱法进行筛查，操作简单、快捷、成本较低；在遇到阳性量品时，结合超高效液相色谱-质谱技术进行确证，实现对化合物的准确定性，最终确保检验结果的准确可信性。

［1］ 丁长河， 钱林， 任惠华， 等. 辣椒制品中苏丹色素的薄层色谱检测方法的研究［J］. 食品科学， 2007， 28（2）: 244-246. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.02.062.

［2］ 张兰天， 王红， 王利军， 等. 高效薄层色谱法同时快速检测饮料中26种人工色素的研究［J］. 食品工业， 2014， 35（8）: 238-242.

［3］ 王艳春， 李博， 刘晓峰， 等. 超高效液相色谱法同时测定调味品中非法添加20 种工业染料［J］. 中国食品卫生杂志， 2014， 26（5）: 451-455. DOI:10.13590/j.cjfh.2014.05.011.

［4］ 杨琳， 陈青俊， 丁献荣， 等. 反相高效液相色谱法测定食品中的多种黄色工业染料［J］. 食品工业科技， 2011， 32（2）: 350-352. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.02.080.

［5］ 陈永艳， 蒋丽娜， 屈飞飞， 等. 反相高效液相色谱法测定调味品中7种合成工业染料［J］. 食品科学， 2014， 35（6）: 168-171. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201406036.

［6］ QI Ping， ZENG Tao， WEN Zejun， et al. Interference-free simultaneous determination of Sudan dyes in chili foods using solid phase extraction coupled with HPLC-DAD［J］. Food Chemistry， 2011， 125（4）: 1462-1467. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.10.059.

［7］ 黄晓雯. HPLC法测定酱油中罗丹明B、对位红和苏丹红［J］. 广州化工， 2012， 40（16）: 127-129. DOI:10.3969/ j.issn.1001-9677.2012.16.052.

［8］ 黄雅佩， 吴官非， 夏焜， 等. 高效液相色谱法测定鱼肉中的碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O两种工业染料［J］. 化学试剂， 2011（1）: 90-95. DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2013.05.011.

［9］ 苏小川， 黄梅， 甘宾宾， 等. 气相色谱-质谱联用法测定调味品中苏丹红Ⅰ、Ⅱ色素［J］. 理化检验（化学分册）， 2006， 42（12）: 1003-1006. DOI:10.3321/j.issn:1001-4020.2006.12.011.

［10］ 范素芳， 李强， 马俊美， 等. 改进的QuEChERS方法结合液相色谱-串联质谱法测定腐竹和豆干中的二甲基黄和二乙基黄［J］. 色谱， 2015，33（6）: 657-661. DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.01046.

［11］ 严恒， 余婷婷， 蒋丽萍， 等. 液相色谱-串联质谱法检测豆制品中的二乙基黄［J］. 食品安全质量检测学报， 2015， 6（4）: 1459-1463.

［12］ 张协光， 曾泳艇， 黎永乐， 等. 固相萃取-超高效液相串联质谱同时测定食品中苏丹橙 G、二甲基黄、苏丹黑 B［J］. 广东化工， 2012，39（1）: 109-110. DOI:10.3969/j.issn.1007-1865.2012.01.059.

［13］ FENG Feng， ZHAO Yansheng， YONG Wei， et al. Highly sensitive and accurate screening of 40 dyes in soft drinks by liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography B， 2011， 879: 1813-1818. DOI:10.1016/j.jchromb.2011.04.014.

［14］ YOSHIOKA N， ICHIHASHI K. Determination of 40 synthetic food colors in drinks and candies by high-performance liquid chromatography using a short column with photodiode array detection［J］. Talanta， 2008， 74: 1408-1413. DOI:10.1016/ j.talanta.2007.09.015.

［15］ 吕东明， 丁云连， 詹晟， 等. 超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱法检测22 种禁用和限用合成色素［J］. 现代仪器与医疗， 2013， 19（2）: 52-56. DOI:10.3969/j.issn.2095-5200.2013.02.016.

［16］ 杨立新， 路杨， 王丽英， 等. 辣椒面中25 种染色剂的液相色谱筛查及液相色谱串联质谱确证方法体系研究［J］. 中国卫生检验杂志，2014（24）: 3505-3510； 3514.

［17］ 罗诗萌， 赵建忠， 于秋红， 等. 豆制品中15 种工业染料的超快速液相色谱串联四级杆质谱快速筛查法［J］. 职业与健康， 2014， 30（8）: 1052-1055.

［18］ 李娟， 丁晓明， 刘丹丹， 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时检测辣椒制品中4 种工业染料［J］. 河南农业科学， 2014， 43（5）: 130-133. DOI:10.3969/j.issn.1004-3268.2014.05.029.

［19］ 曹鹏， 乔旭光， 娄喜山， 等. 固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中的6 种工业染料［J］. 化学分析， 2011， 39（11）: 1670-1675. DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.01670.

［20］ 施家威， 李继革， 王玉飞， 等. 分散固相萃取-气相色谱-三重四极杆质谱分析蔬菜中112 种农药残留［J］. 色谱， 2012， 30（6）: 602-612. DOI:10.3724/SP.J.1123.2012.02019.

［21］ 沈伟健， 余可垚， 桂茜雯， 等. 分散固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定蔬菜中107 种农药的残留量［J］. 色谱， 2009， 27（4）: 391-400. DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2009.04.003.

［22］ 金芬， 史晓梅， 于志勇， 等. 分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定水果中19 种酸性农药［J］. 分析化学， 2013， 41（3）: 354-359. DOI:10.3724/SP.J.1096.2013.20750.

［23］ 李锋格， 苏敏， 李晓岩， 等. 分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肝中磺胺类、喹诺酮类和苯并咪唑类药物及其代谢物的残留量［J］. 色谱， 2011， 29（2）: 120-125. DOI:10.3724/ SP.J.1123.2011.00120.

［24］ 曹鹏， 牟妍， 高飞， 等. 分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测火锅食材中11 种喹诺酮类药物［J］. 色谱， 2013， 31（9）: 862-868. DOI:10.3724/SP.J.1123.2013.02026.

［25］ 李佩佩， 张小军， 梅光明， 等. 分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测水产品中14 种喹诺酮类药物［J］. 食品科学， 2014， 35（24）: 265-270. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201424051.

Determination of Dimethyl Yellow and Diethyl Yellow in Dried Beancurd and Condiment Using Dispersive Solid-Phase Extraction and HPLC with Diode Array Detector and UPLC-MS/MS

LIN Zihao1，2， ZHOU Qingqiong1， ZENG Xi1， ZHENG Chunhao1， HUANG Siming2， OUYANG Gangfeng2， QI Ping1，*
（1. Guangzhou Institute for Food Control， Guangzhou 510410， China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275， China）

In this study， a fast and sensitive method for the simultaneous determination of dimethyl yellow and diethyl yellow in dried beancurd and condiment was developed and validated using HPLC coupled with diode array detector （DAD） and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The two dyes were extracted with hydrochloric acid-acetonitrile. The extracts were further purified with dispersive solid-phase extraction （dSPE） procedure using C18to reduce matrix interference. The validation of the UPLC-DAD method was performed using HPLC-MS/MS. Good recoveries in the range of 84.7%-110.7% were obtained， with relative standard deviations less than 7%. The HPLC method was economical， simple and suitable for screening of samples，and the UPLC-MS/MS method was sensitive and accurate and suitable for validation of positive samples.

dimethyl yellow； diethyl yellow； high performance liquid chromatography （HPLC）； ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； dried beancurd； condiment

10.7506/spkx1002-6630-201608039

O657

A

1002-6630（2016）08-0217-05

2015-07-20

广州市科技计划项目（2014J4100196）

林子豪（1990—），男，助理工程师，学士，研究方向为食品检验。E-mail：lzh050618@163.com

戚平（1981—），男，高级工程师，博士，研究方向为食品检验。E-mail：gzsp2000@163.com

引文格式：