基于纳米金/石墨烯修饰的超灵敏己二烯雌酚电化学生物传感器

张 洁，吴 珺，王传现，邵科峰，陈昌云，赵 波，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.南京师范大学化学与材料科学学院，南京 210097）

基于纳米金/石墨烯修饰的超灵敏己二烯雌酚电化学生物传感器

张 洁1，吴 珺2，王传现1，邵科峰2，陈昌云2，赵 波2，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.南京师范大学化学与材料科学学院，南京 210097）

利用纳米金/石墨烯复合纳米材料以及己二烯雌酚小分子修饰电极，研制了一种新型的超灵敏己二烯雌酚复合纳米电化学生物传感器；制备了己二烯雌酚抗原和多克隆抗体；并以K3Fe（CN）6为探针，利用己二烯雌酚抗体与半抗原之间的竞争反应实现了对己二烯雌酚的超灵敏电化学免疫检测。结果表明：纳米金/石墨烯复合纳米材料具有优异的增敏性和可修饰性。研制的复合纳米电化学生物传感器具有很高的检测灵敏度，己二烯雌酚质量浓度在1～6 000 ng/mL的范围有良好的线性关系，检测限可达到0.05 ng/mL；传感器修饰己二烯雌酚小分子具有简单、重复性和稳定性好的优点。对猪肉、鸭肉、牛肉以及奶粉实际量品进行了己二烯雌酚含量的分析，平均回收率在96.5%～103.7%之间，结果令人满意。

纳米金；石墨烯；复合纳米材料；电化学生物传感器；己二烯雌酚

张洁， 吴珺， 王传现， 等. 基于纳米金/石墨烯修饰的超灵敏己二烯雌酚电化学生物传感器［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 201-206. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608036. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jie， WU Jun， WANG Chuanxian， et al. A supersensitive electrochemical immunosensor based on gold nanoparticle/ graphene composite modified electrode for dienestrol detection［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 201-206. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608036. http://www.spkx.net.cn

己二烯雌酚（结构如图1所示）是一类作用很强的环境激素，大量使用后会干扰人的内分泌、造成胎儿畸形、诱发生殖器病变与肿瘤等多种病变，是动物源性食品和环境中检出率最高、危害最严重的化学性残留危害物之一。我国、欧盟、日本和美国都将其列为不能在任何动物制食品以及这些动物的饲料和生长环境中使用的禁用兽药。检测技术是危害物监管的关键环节，而己二烯雌酚的检测方法目前主要集中在色谱法［1-5］，鲜见有效的快速检测方法。

图1　己二烯雌酚结构式Fig.1 Structure of dienestrol

生物传感器是利用生物活性物质的专一识别功能，有选择地检测待测物。它以选择性好、不需要量品复杂预处理能直接应用于复杂量品的检测等特点而受到广泛重视［6-7］。构建己二烯雌酚高灵敏快速检测的生物传感器的关键环节包括：1）高灵敏和适合于固定生物活性分子的传感器表面构建；2）能特异性识别待测物的抗原抗体。

纳米金和石墨烯因其具有独特的电子特性和表面微结构、高的表面活性、强吸附力等优异特性［8-10］，可在增加生物分子的吸附量和稳定性的同时提高生物分子的催化活性，从而大大增加传感器的灵敏度［11-16］，在食品安全［17-18］、环境和药物小分子［19-23］的检测等领域得到重视。本实验研制己二烯雌酚抗原抗体；将纳米金/石墨烯复合材料组装于工作电极表面，并修饰己二烯雌酚小分子；将复合纳米技术、免疫分析技术和电化学传感技术有机结合，研制速度快、灵敏度高、不用酶标记等优点的超灵敏己二烯雌酚电化学检测生物传感器。与修饰生物大分子的传感器相比，修饰小分子具有机理清楚、简单可控、稳定性和重复性好等优点。是未来分析检测领域的重要发展方向之一，具有重要的实际意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

己二烯雌酚、K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］ 美国Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣马生物技术研究所；KCl 国药集团化学试剂公司；HAuCl4南京化学试剂有限公司；磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）：0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4溶液按一定比例配得。其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2仪器与设备

CHI852C电化学工作站、CHI660E电化学工作站上海辰华仪器有限公司；PHS-3E型pH计 上海今迈仪器仪表有限公司；FA1004分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；KQ-50E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JSM-7600F型高分辨热场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3方法

1.3.1石墨烯和传感器的制备

石墨烯通过采用Hummers法制备［24-25］。玻碳电极分别用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨成镜面，然后超声清洗，利用循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法对该电极的峰电流的差值进行检测，保证峰电流差值小于100 mV。

通过电化学沉积法在0.1 g/L的HAuCl4溶液中将纳米金粒子电镀至玻碳电极表面，再分别滴加4 μL 2.5 g/L石墨烯悬浮液和2 μL 0.2 g/L的己二烯雌酚标准溶液，晾干后用5%的BSA对电极表面的活性位点进行封闭。

1.3.2己二烯雌酚多克隆抗体的制备

1.3.2.1己二烯雌酚免疫抗原的合成

将97 mg己二烯雌酚半抗原加入6.5 mL二氧六环使其溶解，并加入40 μL氯甲酸异丁醋反应30 min后，再与溶于330 mg BSA 18 mL的50%二氧六环溶液的进行反应。将pH值调整至8.0左右，在4 ℃条件下搅拌过夜。经过72 h透析后，4 ℃条件下离心，冰冻干燥，制得己二烯雌酚免疫抗原。

1.3.2.2己二烯雌酚多克隆抗体的制备

采用雄性大耳兔为免疫动物，以己二烯雌酚抗原为免疫原，免疫剂量为1.5 mg/kg。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，背部皮下多点注射。间隔2 周用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂进行加强免疫，剂量、方法同首免。最后一次免疫不加佐剂，7 d后心脏采血，以间接酶联免疫吸附实验法测定血清抗体效价，并用硫酸化沉淀法得到纯化的己二烯雌酚多克隆抗体，-20 ℃保存。

1.3.3紫外-可见吸收光谱的检测

将修饰电极所用石墨烯悬浮液和己二烯雌酚混合液，晾干后，通过超声处理分散溶解于蒸馏水中，通过紫外-可见光谱测定来研究混合物与标准液吸收波长的变化。

1.3.4实际量品前处理

称取适量的猪肉（鸭肉、牛肉）肌肉组织置于量品管中，在量品管中加入一定量的己二烯雌酚标准溶液混合后，使用乙腈-丙酮提取液对量品进行提取，提取液使用氮气吹干后，加入PBS并混合均匀待用。

称取适量的奶粉量品置于量品管中，同量加入一定量的己二烯雌酚标准溶液混合后，使用正己烷作为提取液对量品进行提取，提取液使用氮气吹干后，加入PBS混合均匀待用。

1.3.5检测方法与实验原理

本实验采用三电极体系，其中工作电极为玻碳电极，参比电极为Ag/AgCl参比电极，对电极为铂丝电极。通过CV法以及电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectrum，EIS）法对传感器进行电化学表征，使用差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法进行实验条件优化，并实现对己二烯雌酚的检测。

己二烯雌酚的检测是基于孵育液中的抗体和半抗原与电极表面修饰的半抗原之间的竞争，己二烯雌酚与己二烯雌酚多克隆抗体存在很强的特异性结合，将制备好的传感器在含有抗体以及游离的己二烯雌酚的孵育液中进行孵育时，修饰于电极表面的己二烯雌酚和游离的己二烯雌酚都能与抗体进行竞争结合。孵育液中半抗原与抗体结合的越多，则与电极表面固定的半抗原就结合的少，反之电极表面固定的的半抗原与抗体结合的多，与游离的半抗原就结合的少。

通过DPV来检测游离半抗原与固定半抗原和抗体之间进行结合时产生的电流响应的变化，从而实现对己二烯雌酚的检测。如图2所示为纳米金/石墨烯/己二烯雌酚生物传感器检测己二烯雌酚过程原理图。

图2　生物传感器检测己二烯雌酚过程原理图Fig.2 Principle of the electrochemical immunosensor for dienestrol detection

2　结果与分析

2.1修饰电极的表征

2.1.1扫描电镜

图3a显示，电极表面的纳米金粒径在200～250 nm之间，分布均匀。纳米金具有优异的增敏性和生物相容性，能有效保持生物分子的活性，这是构建生物传感器的关键环节。本实验对Hummers法制备的石墨烯也进行了形貌表征，图3b显示了其典型的片层结构，表面褶皱是由于石墨烯很薄的片层结构容易折叠所导致。石墨烯中的碳原子采取sp2杂化构成的蜂窝状结构，每个碳的剩余电子形成的大π共轭体系，从而形成优良的导电性，加之其很高的比表面积，具备优良的可修饰性，是构建高灵敏电化学传感器的优异材料。图3c和图3d为同时修饰纳米金及石墨烯的电镜图，图中显示石墨烯片层结构分布在纳米金粒子中，说明纳米金/石墨烯都已修饰在电极表面。

图3　纳米金以及石墨烯扫描电镜图Fig.3 SEM of gold nanoparticles （GNPs）， grapheme and their composite

2.1.2紫外-可见吸收光谱

图4　修饰电极材料的紫外-可见吸收光谱Fig.4 UV spectra of surface-modifying materials

己二烯雌酚稳定地修饰在石墨烯表面是制备传感器的关键环节，为了验证己二烯雌酚小分子成功地修饰在了电极表面，分别对修饰电极的己二烯雌酚标准溶液、石墨烯悬浊液以及石墨烯/己二烯雌酚混合溶液进行了紫外-可见吸收光谱的测定。由图4可知，己二烯雌酚标准溶液在228.5 nm波长处有明显的吸收峰，石墨烯没有明显的吸收峰，石墨烯-己二烯雌酚复合物则在226.5 nm波长处有紫外吸收峰与己二烯雌酚的特征吸收峰相近。己二烯雌酚通过物理吸附方式修饰于石墨烯表面，它们之间可能包括两个方面的作用力：一方面是，由于石墨烯具有电子富集性的大π共轭体系，会与己二烯雌酚的羟基之间容易形成氢键；另一方面是，己二烯雌酚结构中的苯环也是大π共轭结构，与石墨烯的大π共轭体系可形成π…π作用。这两种分子间作用力影响了己二烯雌酚的电子性质，从而使其电子光谱发生了变化。由此可见，己二烯雌酚小分子已经被固定在石墨烯表面。

2.1.3电化学表征

图5　不同修饰电极的CV法图谱Fig.5 CV of different modified electrodes

通过CV法以及EIS研究修饰电极不同阶段的界面性质。传感器以K3［Fe（CN）6］为标记物，在含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］的PBS溶液中进行CV图谱的扫描，其结果如图5所示。曲线a为裸电极在K3［Fe（CN）6］中表现出一对明显的氧化还原峰。在电极表面修饰纳米金（曲线b）以及石墨烯（曲线c）后氧化还原峰发生了明显的增强，己二烯雌酚不具有电化学活性故对曲线c的峰电流没有影响。将制备好的纳米金/石墨烯/己二烯雌酚传感器浸入含有己二烯雌酚多克隆抗体的孵育液中孵育后，再对该电极进行CV测定，如曲线d所示，孵育液中的抗体与电极表面修饰的半抗原发生了免疫结合，形成的复合物附着在电极上，阻碍电子传递导致峰电流下降。这同时也可以证明己二烯雌酚以及抗体已经固定在电极表面了。

另外，制备好的传感器在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］溶液中进行EIS的测定。图6展示了不同修饰电极在修饰过程中典型的Nyquist图，图中在高频区显示出的半圆弧形直径代表电荷转移电阻。曲线a与插入图为裸电极的电化学阻抗。在裸电极表面经过电化学沉积纳米金后，修饰电极的电荷转移电阻值相对于裸电极有很大的减小（曲线b）。该修饰电极的电荷转移电阻值随着石墨烯的修饰进一步减小（曲线c）。己二烯雌酚不具有电化学活性，对电荷转移电阻并无影响（曲线d）。用BSA封闭活性位点后，传感器在含有己二烯雌酚多克隆抗体孵育液中进行孵育，抗体与电极表面修饰的己二烯雌酚发生了免疫结合形成了半抗原-抗体复合物，复合物具有不导电性阻碍了回路中电子的传递，电荷转移电阻值增加（曲线e）。电化学抗阻图谱结果表明己二烯雌酚以及抗体已经固定在电极表面，这与CV图谱结果显示一致。

图6　不同修饰电极的EIS图Fig.6 EIS of different modified electrodes

2.2检测己二烯雌酚影响因素的优化

图7　检测己二烯雌酚影响条件的优化Fig.7 Optimization of experimental conditions for detecting dienestrol

2.2.1孵育时间的优化

为了让半抗原和抗体在孵育过程中能够完全竞争结合，在实验过程中孵育时间尤为重要。首先对孵育时间进行优化，将传感器在含有相同质量浓度的己二烯雌酚抗体的PBS溶液中分别进行不同时间的孵育，用PBS冲洗后进行DPV扫描。如图7a所示，在30 min前，己二烯雌酚半抗原与己二烯雌酚多克隆抗体发生了竞争结合，形成的半抗原-抗体复合物，阻碍电极表面电子的传递，导致了DPV相应电流值的逐渐下降。在30 min之后，传感器表面的半抗原与孵育液中的半抗原跟抗体的竞争几乎达到了平衡，电极表面的复合物不再增加，响应电流值不在下降。延长孵育时间对DPV峰电流值影响不大，故选取30 min作为竞争结合的最优时间。

2.2.2孵育液中抗体量的优化

半抗原与抗体的竞争结合时提供的抗体量也是影响实验的重要因素。将传感器在50 μL含有不同量己二烯雌酚抗体的PBS溶液中分别进行孵育30 min，用PBS冲洗后进行DPV进行扫描。结果如图7b所示，随着抗体量不断增加，电流响应值也不断下降。当抗体添加量达到6 μL后，固定在电极表面的己二烯雌酚和孵育液中己二烯雌酚与抗体竞争几乎达到了平衡，不再形成半抗原-抗体复合物，响应电流值几乎不变，再增加孵育液中抗体量对DPV峰电流值影响不大，故选取6 μL作为孵育时的最优抗体量。

2.3己二烯雌酚的检测结果

图8　己二烯雌酚的检测Fig.8 Detection of dienestrol

为了实现传感器对己二烯雌酚的检测，将传感器置入含有己二烯雌酚以及其抗体的孵育液中孵育30 min后，使用PBS清洗。如图8所示，与不含游离己二烯雌酚的DPV响应电流值相比，随着己二烯雌酚质量浓度的增加响应电流值也随之增大。定义在孵育液中不含己二烯雌酚时响应电流为I0，Ix为孵育液中含有不同质量浓度己二烯雌酚时所测得的响应电流，响应电流变化值ΔI（ΔI=Ix-I0）与质量浓度在1～6 000 ng/mL范围内的己二烯雌酚有良好的线性关系（r=0.981 41），最低检测限可达到0.05 ng/mL。实验结果表明，由于纳米金/石墨烯复合纳米材料极好的导电性，使得该生物传感器实现了对己二烯雌酚宽范围、超灵敏的检测。

2.4实际量品的检测结果

表1　实际样品（猪肉、鸭肉、牛肉和奶粉）加标处理检测己二烯雌酚实验结果Table 1 Recoveries of dienestrol from spiked samples of pork， duck，beef and milk powder

分别对4 种不同的实际量品进行了回收率实验。经过前处理的量品分别在高、中、低3 个添加量进行各3 次检测，通过线性关系计算得到回收率。如表1所示，猪肉实际量品的回收率为90.3%～104.4%，鸭肉实际量品的回收率为86.8%～106.0%，牛肉实际量品的回收率为101.7%～109.1%，奶粉实际量品的回收率为91.3%～111.1%。结果表明，制备的纳米金/石墨烯/己二烯雌酚传感器具有很好的实用性，完全适用于动物源性食品中己二烯雌酚的检测。

2.5纳米金/石墨烯/己二烯雌酚生物传感器的以稳定性及重复性

生物传感器的重复性以及稳定性对该传感器是很重要的衡量指标。本实验利用DPV法，对传感器的稳定性进行了测试。将制备的生物传感器重复在2 mmol/L的K3［Fe（CN）6］溶液中进行扫描10 次，该传感器的响应电流变化值相对标准偏差小于10%，结果表明成功研制了基于纳米金/石墨烯复合材料，具有很好稳定性的新型电化学生物传感器。

本实验还对该传感器的重复性进行了研究。将制备的生物传感器放置在空气中，每天对该传感器进行DPV扫描，经过7 d测得生物传感器的响应电流变化值相对标准偏差小于10%，结果表明该传感器的重复性可以接受。

3　结 论

本实验成功研制了一种通过半抗原-抗体竞争，用于检测己二烯雌酚的超灵敏电化学生物传感器。基于电极表面沉积纳米金颗粒以及修饰石墨烯这两种复合纳米材料，纳米金和石墨烯良好的生物相容性以及导电性，提高了传感器检测灵敏度、稳定性以及重复性。该传感器具有快速、灵敏、价格低、检测限低以及检测范围广的特点，可以实现对己二烯雌酚的快速检测。这种生物传感器的研制在检测方面存在着巨大潜力，有着良好的前景，为实现更多快速检测提供了参考。

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A Supersensitive Electrochemical Immunosensor Based on Gold Nanoparticle/Graphene Composite Modified Electrode for Dienestrol Detection

ZHANG Jie1， WU Jun2， WANG Chuanxian1， SHAO Kefeng2， CHEN Changyun2， ZHAO Bo2，*
（1. College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China；2. College of Chemistry and Material Science， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

A novel electrochemical immunosensor was developed by modifying the electrode with gold nanoparticles/ graphene composite material. The immunogen was prepared by conjugating dienestrol （hapten） to the carrier protein （bovine serum albumin） and used to generate polyclonal antibodies. Cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry were employed to monitor the fabrication process of immunoreaction system in solutions containing the redox probe K3Fe（CN）6. The results revealed that gold nanoparticle/grapheme composites could effectively modify the electrode and enhance its sensitivity. The biosensor showed excellent detection performance with a broad linear range of 1-6 000 ng/mL and a supersensitive detection limit of 0.05 ng/mL. In addition， the biosensor modified with the small molecule of dienestrol had the advantages of simplicity， reproducibility and stability. Good recoveries in the range of 96.5%-103.7% were obtained in the detection of pork， dunk， beef and milk powder samples.

gold nanoparticles； graphene； composite materials； electrochemical biosensor； dienestrol

10.7506/spkx1002-6630-201608036

TS202.3

A

1002-6630（2016）08-0201-06

2015-04-16

江苏省科技厅科技支撑计划社会发展项目（BE2014720）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（14）2127）

张洁（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全分析与检测。E-mail：348657754@qq.com

赵波（1969—），男，教授，博士，研究方向为食品安全检测与预警。E-mail：zhaobo@njnu.edu.cn

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