基于GC-MS和电子鼻技术的金枪鱼胰脏酶解气味解析

钱琴莲，李 晔，王求娟，王 颖，苏秀榕，*

（1.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2.宁波今日食品有限责任公司，浙江 宁波 315500）

基于GC-MS和电子鼻技术的金枪鱼胰脏酶解气味解析

钱琴莲1，李 晔1，王求娟2，王 颖1，苏秀榕1，*

（1.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2.宁波今日食品有限责任公司，浙江 宁波 315500）

目的：对不同蛋白酶水解金枪鱼胰脏的风味物质比较分析，为金枪鱼胰脏深加工提供参考。方法：以不加蛋白酶作对照，不同蛋白酶水解金枪鱼胰脏，利用电子鼻和顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪，对酶解液气味的响应值进行载荷分析、主成分分析和成分的定性定量分析。结果：电子鼻测得不加酶组与菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶组间气味存在明显差异。HS-SPME-GCMS法分别检测出45、54、54、34、46、43、53 种和50 种挥发性成分，主要为烃类、醇类、醛类、酮类、呋喃类等化合物。增香的丁香醛、β-紫罗兰酮和2-乙基呋喃均在动物蛋白酶组中相对含量最高。腥味物质在木瓜蛋白酶组、风味蛋白酶组和胰蛋白酶组中相对含量较低。结论：动物蛋白酶组能明显增加怡人香味，而木瓜蛋白酶组、风味蛋白酶组和胰蛋白酶组对腥味有较好的改善作用。

金枪鱼胰脏；蛋白酶水解；挥发性物质；顶空固相微萃取；电子鼻；气相色谱-质谱联用

钱琴莲， 李晔， 王求娟， 等. 基于GC-MS和电子鼻技术的金枪鱼胰脏酶解气味解析［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 121-126.

胰腺是高等动物体内具有分泌功能的实体性腺体，含有蛋白质、胰酶、激素、多肽、氨基酸、核苷酸、脂类、多糖等活性物质［1］。金枪鱼胰脏与陆生动物相比较更为发达，约占金枪鱼总内脏质量的27%（鳃除外），将胰脏酶解可产生多肽、氨基酸等活性成分［2］。蛋白酶可将大分子蛋白质酶解成具有生物活性的小肽，王霞等［3］利用黄鳍金枪鱼胰脏酶解液改善糖尿病大鼠血糖、血脂，促进糖代谢和脂代谢的良性循环。由于各种蛋白酶都具有相对的底物专一性，不同蛋白酶其作用位点也不一量，因此，不同蛋白酶会对酶解液的营养价值和风味起重要作用［4-8］。本实验利用电子鼻系统，分析不同蛋白酶处理的金枪鱼胰脏挥发性物质的变化差异，并结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）检测胰脏的挥发性成分，以期探明金枪鱼在不同蛋白酶或不加酶的条件下整体风味上的差异，为今后金枪鱼胰脏酶解的加工工艺提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金枪鱼胰脏 浙江宁波今日食品有限公司；菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

PEN3便携式电子鼻系统 德国AirSense公司；QP2010 GC-MS联用仪 日本岛津公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/ carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、65 μm PDMS萃取头 美国Supelco公司。

1.3方法

1.3.1金枪鱼胰脏酶解液的制备

将清洗、沥干后的胰脏放于组织搅碎机中打碎。实验组量品：在底物质量浓度50 g/100 mL、加酶量为底物质量的1%、温度55 ℃、时间6 h的酶解条件下制备酶解液；对照组量品：加酶量为0，其余条件与实验组相同。

1.3.2量品处理

PEN3电子鼻的金属氧化物电子鼻传感器对各组量品不同气味分子在其表面的化学作用转化为电信号，从而得到不同的响应值，PEN3电子鼻10个传感器对应挥发性风味物质见表1。

电子鼻量品前处理：取各组量品200 μL于15 mL的量品瓶中密封，用于电子鼻检测。每组量品设5 个平行。

GC-MS：取各组量品5 mL于15mL SPME顶空瓶中，密封30 min后，将经过老化处理过的50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取头（65 μm PDMS）插入顶空瓶中，于60 ℃水浴吸附30 min，迅速将萃取头置于进量口250 ℃解吸2 min，进行GC-MS分析。

表1　PEN3所用传感器及其性能描述Table 1 Sensors used and their main application in PEN3

1.3.3检测条件

电子鼻：量品进量流量为300 μL/min，测量时间为196 s和197 s，清洗时间200～500 s。

GC条件：VOCOL毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）；进量口温度与接口温度均为210 ℃，检测温度210 ℃；程序升温：起始柱温35℃保持2 min，以3 ℃/min升至40 ℃，保留1 min，再以5 ℃/min升至210 ℃，保持25 min；采用不分流进量模式，恒压35 kPa；载气为He，流速为0.3 mL/min。

MS条件：电子电离源；离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；质量扫描范围33～500 u；扫描时间35 min。

1.4数据处理

电子鼻测定结果利用WinMuster进行响应值分析、载荷分析以及主成分分析（principle component analysis，PCA）。GC-MS数据检测结果通过计算机检索谱库Wiley及NIST 08相互匹配进行定性分析。将谱库中化合物相似度低于80（最大值为100）的组分标为未鉴定出。各组分相对含量按照峰面积归一化法计算。

2　结果与分析

2.1电子鼻检测

2.1.1不同传感器的响应值分析

图1　电子鼻传感器对不同酶解液挥发性物质的响应值Fig.1 Responses of electronic nose sensors to volatile substances of different hydrolysates

对各组的电子鼻检测结果分别取平均值，得到不同传感器响应值与各组挥发性风味的关系如图1所示，S2、S6和S8这3 个传感器的响应值较高。实验组与对照组在S4、S5、S7和S10这4 个传感器中响应值相差均极显著，而传感器S1和S6两组均相差不显著，传感器S3中对照组和中性蛋白酶组响应值相差不显著，说明在分析各组风味上，S4、S5、S7和S10参考性大，在S1、S3和S6参考性较小。

2.1.2载荷分析

图2　电子鼻10 个传感器响应值的载荷分析Fig.2 Loadings analysis of responses of ten electronic nose sensors

通过载荷分析，如图2所示，可以得出电子鼻的10 个传感器分别对量品的PCA的贡献率：在PC1贡献率方面，S2传感器贡献率最大，其余传感器相差较小；而在PC2贡献率方面，S7传感器贡献率最大。响应值分析和载荷分析表明，不同的传感器对量品的响应值不同，由响应值可推出对照组与实验组的显著性差异不同，各传感器的载荷贡献率差异明显，据此可对传感器进行选择与优化，使电子鼻检测达到更优的结果。综上可知，选择S2、S4、S5、S7和S10传感器的响应值对不同蛋白酶优化胰脏酶解液风味进行PCA。

2.1.3PCA

图3　加酶实验组和不加酶对照组的PCAFig.3 PCA analysis of odors of intact and hydrolyzed tuna pancreas

PCA是将所提取的传感器多指标化为少数几个综合指标的一种线性判别方法，最后在PCA分析的散点图上显示主要的两维散点图。由金枪鱼胰脏在不同蛋白酶作用下的PCA，由图3可知，PC1贡献率为96.17%，PC2贡献率为1.90%，总贡献率达98.07%，说明PCA可用于区分各组的挥发性气味。在相同实验条件下，各组均区分度较明显，对照组与菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的气味呈现一定的聚类现象，但仍能有效区分。各组均在各自区域，不发生重叠，说明各组间均存在差异，具有一定的研究价值。因此，选用S2、S4、S5、S7和S10这5 个传感器的响应值做PCA。

2.2HS-SPME-GC-MS测定结果

图4　胰脏酶解液的的挥发性物质种类分析Fig.4 Classification of volatile compounds identified in protein hydrolysates from tuna pancreas

由图4所示，由GC-MS分析发现菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶实验组，以及不加酶对照组分别进行鉴定，分别得到45、54、54、34、46、43、53 种和50 种挥发性成分，从而可知经蛋白酶处理的酶解液挥发性物质总数中木瓜蛋白酶最少，动物蛋白酶和碱性蛋白酶最多。利用二元变量Jaccard系数［9］，对照组和实验组相似度分别为菠萝蛋白酶组61.02%、动物蛋白酶组76.27%、碱性蛋白酶组70.50%、木瓜蛋白酶组52.73%、风味蛋白酶组65.52%、胰蛋白酶组57.63%和中性蛋白酶组77.59%。从而可知木瓜蛋白酶组的酶解液风味可能与不加酶对照组相差最大。利用电子鼻检测发现每组处理都能明显分开，但是因为电子鼻只能够对气味的整体特征作出响应，不能对每一种单独的挥发性物质作出响应，因此需要用GC-MS来进一步检测分析，以此找出不同组风味上的具体差异。

2.2.1烃类化合物及风味

表2　金枪鱼胰脏对照组和实验组的挥发性物质相对含量Table 2 Relative contents of volatile compounds in the control and the experimental groups%

续表2%

续表2%

部分烷烃类可能源于脂肪酸降解，芳香烃则可能是由带芳香基的游离氨基酸氧化产生的［10］。由表2可知，十五烷在所有组中均存在，且相对含量在所有烃类中最高，它与同量存在于各组的十七烷是天然鱼香及其饵料硅藻的共同香气物质。十五烷和十七烷可能是通过烷基自由基的脂质自氧化或类胡萝卜素的分解生成，其阈值较高，因此对各组风味的形成直接贡献不大，但有助于提高胰脏酶解液整体香味效果［11］。实验组中的菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶组的十五烷和十七烷总量明显低于不加酶对照组，烃类含量的减少意味着可能其他风味贡献率大的挥发性物质相对含量的增多，对胰脏酶解液风味的复杂性起到一定作用。

2.2.2醇类化合物及风味

多数醇类化合物阈值较高，其中的直链饱和醇的香味对金枪鱼胰脏酶解液的贡献率较低，而一些不饱和醇的阈值较低，并具有蘑菇香气和类似金属味，对金枪鱼胰脏酶解液的贡献率较高［12-13］。由表2可知，除动物蛋白酶组外，其他组醇类相对含量均比不加酶对照组高，其中菠萝蛋白酶组最高，实验共检出14 种醇类化合物，占总挥发性物质的9.89%～20.87%，均存在的醇类有1-辛烯-3-醇、5-甲基-1-己炔-3-醇、2，7-辛二烯-1-醇和E，E-壬-2，4-二烯醇。1-辛烯-3-醇是一种亚油酸的氢过氧化物的降解产物，表现出类似蘑菇的香气，普遍存在于鱼类的挥发性香味物质中［14］。1-戊烯-3-醇是菠萝蛋白酶组中特有的，1-戊烯-3-醇具有水果香味、青草香，是沙丁鱼、白鲑鱼以及鲭鱼的典型风味成分。除动物蛋白酶组和中性蛋白酶组外，其余实验组中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇的总量均高于不加酶对照组。由于醇类物质能产生品质较为柔和的水果香味［15］，因此认为其在胰脏酶解液整体风味中起贡献鲜香味的作用。

2.2.3醛类化合物及风味

由表2可知，本次实验共检测出25 种醛类化合物。在各组中，除木瓜蛋白酶组外，醛类化合物相对含量均位列第二，并且醛类化合物的阈值通常比其他化合物低，具有脂肪香味，因此，此类化合物对胰脏加热后的整体风味有重要作用［16-17］。苯甲醛具有强烈的甜橙气息、炒花生香以及腥味［18］，苯甲醛在对照组中相对含量最高，通过酶解，苯甲醛相对含量降低，说明通过蛋白酶的水解，明显改变了胰脏加热后的风味。2，4-癸二烯醛则会呈强烈的鸡香和鸡油味，在动物蛋白酶和碱性蛋白酶组中相对含量最高达1.97%［19］。壬醛、庚醛具有强烈的油脂气味和鱼腥味壬醛还具有柑橘量风味，实验组中两者总相对含量均比对照组高。己醛通常产生一种原生味、鲜香和类醛的特征香味［20］，主要来自ω-6不饱和脂肪酸，己醛在含量较高时，具有青草味-脂肪味［21］，各组中相对含量均在2%～5%之间，相差不大，给人以淡淡的清香。在各组中均含有清新果香的丁香醛，且相对含量都在2%以上，动物蛋白酶组和中性蛋白酶组通过对金枪鱼胰脏酶解，将丁香醛对照组相对含量为2.76%分别上升到7.29%和9.25%之多，对胰脏酶解液整体风味有较大改善。

2.2.4酮类化合物及风味

酮类化合物可能是由于多不饱和脂肪酸热氧化、氨基酸降解或微生物氧化产生的，具有独特的清香和果香风味，并且随着碳链的增长给出更强的花香特征，对胰脏酶解液特殊香味的形成有着重要作用［22］。由表2可知，实验共检测出15 种酮类化合物。在各组中均存在，相对含量相差不大的2，3-辛二酮对其奶油香气有贡献［23］。E，E-3，5-辛二烯-2-酮能带来水果香，因此该物质的存在可能会对胰脏酶解液风味产生较好影响。β-紫罗兰酮具有浓郁的紫罗兰香气，接近烟草的木香、果香和甜的气味，是一种名贵香料，此外β-紫罗兰酮具有较强的生物活性，对肿瘤的发生有明显的抑制作用［24］。β-紫罗兰酮在各组中均能检测出，并且蛋白酶组中所含β-紫罗兰酮的相对含量均高于不加酶组，动物蛋白酶组相对含量最高达2.05%，因此通过动物蛋白酶酶解，使得酶解液带有类似清新的花香。

2.2.5呋喃类化合物及风味

呋喃类化合物来源于氨基酸与还原糖间的美拉德反应以及氨基酸的热分解反应，它们大都具有很强的肉香味以及极低的香气阈值，对金枪鱼酶解液风味的形成具有重要影响。2-戊基呋喃具有类似火腿香味，2-乙基呋喃有强烈的肉香味、焦香味和甜味，产生诱人的芳香味［25］。不加酶对照组2-乙基呋喃相对含量仅为0.38%，通过添加动物蛋白酶进行酶解，相对含量上升到5.75%，由此可以看出，动物蛋白酶可对胰脏酶解液有增香作用。

3　结 论

通过电子鼻测定，在整体风味上，不同蛋白酶处理金枪鱼胰脏具有明显差异。胰脏加热后，无论有无加酶均产生了多种挥发性成分，木瓜蛋白酶水解液的种类数与不加酶蛋白酶实验组相差较大。碱性蛋白酶组和动物蛋白酶组中烃类化合物相对含量最少，因此这2 组的风味较其他组要浓郁和复杂。醇类化合物在整体风味中主要起增加鲜香味的作用，动物蛋白酶组醇类物质相对含量仅比不加酶组少1.10%，其他加酶组的醇类物质相对含量均比不加酶组高，说明酶解液对风味改善具有一定作用。1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、E，Z-2，6-壬二烯醛、Z-4-庚烯醛、苯甲醛、2，4-庚二烯醛、壬醛、2，4-壬二烯醛和E，E-3，5-辛二烯-2-酮等是鱼肉中产生腥味的化合物［26-28］，在不加酶，添加菠萝蛋白酶、动物蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶不同处理条件下，腥味物质相对含量分别为20.59%、20.88%、20.07%、25.45%、15.69%、14.89%、14.53%和18.22%。由此可见，木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶对胰脏酶解液腥味形成有明显改善。带有怡人果香味的丁香醛，在中性蛋白酶组和动物蛋白酶组中相对含量分别为9.25%和7.29%，可对腥味有一定的掩盖作用，提高了胰脏酶解液的可接受度。为整体风味贡献较大的β-紫罗兰酮，在动物蛋白酶组含量最高，使得酶解液带有类似清新的花香。2-戊基呋喃具有类火腿香味，2-乙基呋喃有强烈的肉香味、焦香味和甜味，产生诱人的芳香味，这2 种物质在动物蛋白酶中相对含量也最高。以上可以看出，动物蛋白酶可对胰脏酶解的风味有较大的改善。

通过电子鼻和GC-MS数据综合分析表明，木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的腥味比其他组低，且具有去腥效果，动物蛋白酶酶解液具有多种高含量的优质风味物质，风味改善效果明显，为今后金枪鱼胰脏酶解液制品以及其他类似产品提供参考和理论依据。

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Analysis of Volatile Flavor Compounds of Tuna Pancreatic Protein Hydrolysates Produced by Different Proteases

QIAN Qinlian1， LI Ye1， WANG Qiujuan2， WANG Ying1， SU Xiurong1，*
（1. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China； 2. Ningbo Today Food Co. Ltd.， Ningbo 315500， China）

Objective: To compare the volatile flavor compounds of tuna pancreatic protein hydrolysates produced by different proteases and therefore to provide references for deep processing of tuna pancreas. Methods: An electronic nose was used to detect odors of tuna pancreatic tissue as a control and its enzymatic hydrolysates. The sensor array was optimized by loading analysis for principal component analysis （PCA）. Headspace solid-phase micro extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS） was used to identify and compare the volatile flavor components of all the above samples. Results: PCA analysis revealed that electronic nose enabled the detection of significant differences in odors of the control， bromelain， animal protease， alkaline protease， papain， flavorzyme， trypsin and neutral protease groups. A total of 45， 54， 54， 34， 46， 43， 53 and 50 volatile substances were identified by HS-SPME-GC-MS in these groups， respectively， mainly including hydrocarbons， alcohols，aldehydes， ketones and furans. The flavor compounds syringaldehyde， β-ionone and 2-ethyl-furan were the most abundant in the animal-derived protease groups. The relative contents of fishy odor compounds in the papain， flavorzyme and trypsin groups were lower than those in other groups. Conclusion: The hydrolysis of tuna pancreas with animal-derived proteases could significantly enhance pleasant flavor. Papain， flavourzyme and trypsin have better effects on deodorization.

tuna pancreas； proteases； volatile substances； headspace solid-phase micro extraction （HS-SPME）； electronic nose； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

10.7506/spkx1002-6630-201608021

TS254.1

A

1002-6630（2016）08-0121-06

10.7506/spkx1002-6630-201608021. http://www.spkx.net.cn QIAN Qinlian， LI Ye， WANG Qiujuan， et al. Analysis of volatile flavor compounds of tuna pancreatic protein hydrolysates produced by different proteases［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 121-126. （in Chinese with English abstract）

10.7506/ spkx1002-6630-201608021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-19

国家海洋区域发展创新示范项目（2013710）；宁波市科技局农业与社发重大科技项目（2010C10040）

钱琴莲（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品检测与研发。E-mail：953452623@qq.com

苏秀榕（1956—），女，教授，博士，研究方向为食品科学与工程、生物化学与分子生物学。

E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn

引文格式：