EDC/NHS法制备免疫磁珠及其效果验证

张尔力（湖南警察学院，湖南　长沙　410138）

EDC/NHS法制备免疫磁珠及其效果验证

张尔力（湖南警察学院，湖南长沙410138）

免疫磁珠又叫免疫磁性微球，是免疫学和磁性微球结合而发展的一类新型材料，一般用于物质的提取和分离，由于其高效、低毒等特性，目前在生物化学领域、医药领域、食品检测领域应用广泛。本文主要应用EDC/NHS法活化羧基磁珠，再将人类精子特异性抗体与之偶联，最后制备成免疫磁珠，进行细胞捕获实验，分别捕获人类的上皮细胞和精子，提取DNA，进行PCR（聚合酶链式反应），进行电泳，根据STR（短串联重复）图谱的对比验证了这种方法制备的免疫磁珠的偶联效果。实验证实，用EDC/NHS法活化制备的免疫磁珠能选择性地捕获到精子而不能捕获到上皮细胞，该方法制备磁珠效果良好。

新型材料；免疫磁珠；细胞分离与提纯；PCR；STR

磁性分离技术在工业上的应用已经有很长的历史，1979年John Ugelstad［1］等制备了具有超顺磁性聚苯乙烯微球，并将其磁化与抗体连接成分离细胞效果很好的免疫磁珠，使这一技术在生物医药领域开始得到应用。近年来，免疫磁珠分选细胞技术凭借其高效快速、简便易行、无毒无害、低成本、分离纯度高、保留细胞活性等特点，已被应用于临床实验诊断，分离和检测各种肿瘤细胞、骨髓细胞、血细胞、细菌及其他微生物等方面。

抗体与磁性微球的偶联是将单克隆抗体与带有功能基团的磁珠偶联，抗体与磁珠连接的方式有两种：共价偶联（covalent coupling）和物理吸附（physicalabsorption）。物理吸附非常不稳定，在一定的条件下很容易脱落，而共价偶联是抗体与磁珠表面的基团共价结合，使抗体稳固地结合在磁珠上。磁珠上的醛基、环氧基等基团可以直接和目标分子上的氨基结合，而含其他基团的磁珠则需要进行活化才能与目标分子连接。常用的活化方法有：碳二亚胺法、重氮法、烃化法、溴化氰法、戊二醛法、伍德沃德试剂K法等［2］。Molday等［3］把含有羧基的磁性聚合物微球用荧光染料作上标记，经碳二亚胺活化，在微球表面偶联抗体或外源凝集素，对人红血细胞和B淋巴细胞进行了成功分离。国内刘辉荣等［4］用EDC和NHS活化磁珠表面羧基，再和抗体的氨基反应，这样将抗体与磁珠偶联，并用了多种方法检验磁珠与抗体的结合率。精子特异性抗体的特性是只能与精子膜特异性抗原反应而不能与上皮细胞膜蛋白反应。本文采用EDC/NHS法表面抗体修饰羧基磁珠来制备精子特异性抗体免疫磁珠，用细胞捕获的方法来验证磁珠的制备效果。

1　方法原理

EDC/NHS法表面抗体修饰羧基磁珠的原理：基磁珠表面所含的羧基（-COOH）先与现配的EDC溶液反应，生成不稳定的氨基活性O-酰基脲中间体，该中间体可以有三种转化途径：第一种是与溶液中的水反应，还原成羧基磁珠；第二种是与抗体的氨基（-NH2）反应，直接生成免疫磁珠；第三种是不稳定的氨基活性O-酰基脲中间体与NHS反应，生成半稳定的氨基反应活性NHS酯，该产物再与抗体上的氨基反应，生成免疫磁珠。本实验偶联抗体是通过第三种转化途径。

2　主要仪器和试剂

EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺），北京中生瑞泰有限公司；NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），北京中生瑞泰有限公司；MES（2-吗啉乙磺酸），北京中生瑞泰有限公司；EDC溶液：将EDC溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，EDC终浓度50mg/mL；NHS溶液：将NHS溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，NHS终浓度50mg/mL；含有0.1%BSA和0.1%Tween-20的PBS溶液：在PBS中加入BSA和Tween-20，使BSA和Tween-20分别占总溶液质量分数的0.1%；含有0.1%BSA的PBS溶液：在PBS中加入的BSA，使BSA占总溶液质量分数的0.1%；0.05mol/ L pH=7.4 Tris溶液：将0.79g TrisHcl加入到90mL蒸馏水中，调pH值为7.4；100mmol/L pH=5MES溶液：将2.13gMES加入90mL蒸馏水中，pH值为5；AmpFlSTR®Identifiler plus PCR扩增试剂盒包含，美国Applied Biosystems公司；QIAamp DNAM48提取试剂盒；②磁性分离架，美国Promega公司；Dynabeads®M-270CarboxylicAcid羧基磁珠，美国Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒，中国Solarbio公司；Nanodrop_2000c超微量分光光度计，美国Thermo公司；③Anti-JLP抗体，英国abcam公司；④采集健康成年女性的口腔上皮细胞和健康成年男性的精子，分别制备成细胞数约104的细胞悬液。

3　实验方法

免疫磁珠制备有两个主要步骤，第一步是未偶联抗体的磁性微球的制备，第二步是抗体与磁性微球的偶联。本实验采用美国Invitrogen公司的商品化磁珠Dynabeads®M-270CarboxylicAcid羧基磁珠偶联抗体，减少了磁性微球的制备这一过程，直接使用已经制备成功的稳定的羧基功能化磁珠与所选抗体偶联。

表1　免疫磁珠捕获两种细胞成功次数对比

3.1EDC/NHS活化羧基磁珠

将EP管置于磁力架上4min，待磁珠和溶液固液分离，在剩下装有磁珠的EP管中加入50μL 25mmol/LPH=5的MES溶液，充分振荡混合10min，固液分离，重复一次；在洗涤过的磁珠中加入25μL现配的EDC溶液和25μLNHS溶液，充分混合均匀，25℃孵育30min；固液分离，向EP管中加入50μL 25mmol/L PH=5的MES溶液，充分混合，固液分离，重复洗涤磁珠一次。

3.2已活化磁珠偶联抗体反应基本步骤

将30μL抗体（浓度1mg/mL）加入到30μL 25mmol/L MES，PH=5中，加入已活化的磁珠中，振荡混匀，加入40μL 25mmol/LPH=5的MES溶液后置于涡旋振荡器上振荡确保充分混合。混合物在25℃孵育1h，将EP管放在磁力架上4min。磁珠中加入100μL 50mmol/L PH=7.4的Tris溶液，将EP管置于25℃孵育15min，期间缓慢旋转振荡，避免磁珠沉淀。15min后固液分离，移除液体成分。加入100μL含0.1%BSA和0.1% Tween-20的PBS溶液，将EP管置于涡旋振荡仪上，充分振荡摇匀，后将EP管置于磁力架上4min，固液分离，移除液体成分，如此重复4次。之后，将磁珠悬浮在50μL含有0.1%BSA的PBS缓冲液中。

3.3细胞捕获验证

首先按照上文中的方法制备104数量级的人精子悬液和人上皮细胞悬液，取1μL（上皮细胞悬液取100μL）加入EP管中，计数两种细胞数量大致相同，再向EP管中加入10μL免疫磁珠，25℃孵育60min后，固液分离，将余下磁珠尽量完全吸出转移至一新管，用500μL含有0.1%BSA的PBS缓冲液洗涤三次，余下的磁珠进行捕获到的细胞的DNA提取。每种细胞实验重复10次。

3.4DNA的扩增和毛细管电泳检测

用AmpFlSTR®Identifiler Plus PCR扩增试剂盒10μL体系扩增提取出的DNA样本。然后再将整个体系放入热循环仪进行扩增。扩增程序：95℃预变性11min；94℃变性20s，59℃退火3min，循环29次；60℃终延伸30min，15℃保持。每组均设置阳性（9947A）和阴性（空白）对照。在3130XL型遗传分析仪上根据标准步骤检测扩增产物。

4　实验结果

用GenMapper IDv3.2软件进行数据分析，将所得的分型与样本提供者进行比对（表1），将有13个以上基因座分型与精子供者一致，并且各等位基因峰高大于50RFUs定为分型正确的标准，结果用SPSS20统计学软件进行χ2检验。

经χ2检验，P＜0.05，制备出的免疫磁珠对两种细胞的捕获结果的差异具有统计学意义。统计结果显示，Anti-JLP抗体免疫磁珠捕获精子的成功率为100%，而成功捕获上皮细胞的成功率为0。

5　结语

实验结果显示，用EDC/NHS法活化制备的免疫磁珠能选择性地捕获到精子而不能捕获到上皮细胞，实现了预期效果，该方法制备磁珠效果良好。

［1］Ugelstad A.Process for preparing an aqueouse emulsion or dispersion of a party water-solublematerial and use of polymer particles prerared according to thisprocessasa toner in xerography［P］.EP0003905.1979-09-05.

［2］赵永芳.生物化学技术原理及其应用［M］：第二版.武汉：武汉大学出版社，1994.238-241.

［3］Molday RS.Nature，1977，268:437-438.

［4］刘辉荣，徐宏，古宏晨.简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备［J］.中国公共卫生，2008.24（11）：1349-1351.