离子液体分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定牛奶中己烯雌酚

戚 琦，黄 闵，谢海华（.赣南师范学院化学化工学院，江西 赣州 34000；.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 34000）

离子液体分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定牛奶中己烯雌酚

戚 琦1，黄 闵2，谢海华1
（1.赣南师范学院化学化工学院，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000）

建立离子液体分散液-液微萃取与高效液相色谱-紫外检测器相结合测定牛奶中己烯雌酚含量的方法。考察萃取溶剂、抗黏剂、pH值、离子强度及温度对萃取效率的影响。结果表明，该法对样品中己烯雌酚的萃取灵敏度高，检出限为0.5 μg/L，相对标准偏差在2.80%～4.43%之间，平均回收率为93.7%～103.2%。该技术可以满足牛奶中己烯雌酚含量的测定。

离子分散液-液微萃取；牛奶；己烯雌酚；高效液相色谱

己烯雌酚是一种人工合成的雌激素，可用于提高动物的生长速度，其一直作为促进剂用在牛、羊等畜禽饲料中[1]。现已证实它可在动物的肝脏、肌肉、脂肪等处残留，是一种致癌物质，可诱发白血病、子宫癌等疾病[2-4]。由于己烯雌酚的滥用，动物性食品中己烯雌酚的残留检测引起了国内外的高度重视[5-7]。目前国内外报道用于己烯雌酚残留检测的方法很多。主要有气相色谱法[8]、气相色谱-质谱联用法[9-10]、高效液相色谱法[11-12]、液相色谱-质谱联用法[13-14]、电化学法[15-16]、免疫法[17-18]、蛋白质微阵列法[19]和分子印迹传感器[20-21]等。传统的样品前处理技术存在操作繁琐耗时，需要使用大量对人体和环境有毒、有害的有机溶剂等缺点。因此，发展省时高效，有机溶剂用量少的样品前处理新技术，已成为分析化学研究的热点之一。近年来，已发展了多种微萃取技术，例如：固相微萃取[11,22]、液相微萃取[23]、分散液相微萃取[24-25]等。本实验利用绿色溶剂离子液体[Omim][PF6]作萃取溶剂，在超声辅助的作用下，用曲拉通114为抗黏剂，建立了一种新型超声辅助的离子液体冷诱导微萃取的样品前处理技术，并成功应用于牛奶中己烯雌酚的分析检测。该方法集采样、萃取和浓缩于一体，操作简单、快速、成本低、对环境友好且富集效率高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

[Bmim][PF6]、[Hmim][PF6]、[Omim][PF6]（纯度均为99%） 上海成捷化学有限公司；己烯雌酚（纯度为99%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；曲拉通100、曲拉通114（生物技术级） 上海美季生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯；所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

1200系列高效液相色谱仪 美国Agilent公司；TG-16高速离心机 巩义予华仪器设备有限公司；UP900超纯水器 韩国Human Corporation公司；Delta 320 pH仪 美国Mettler-Toledo仪器有限公司；超声清洗器 昆山超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：反相Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；进样量10 μL；流动相：甲醇-水（0.043 mol/L磷酸盐缓冲溶液，65∶35，V/V）溶液；流速1 mL/min。

1.3.2 样品处理

取2.5 g牛奶于25 mL离心管中，加5 mL磷酸盐溶液（pH 5），混匀后离心（4 000 r/min，10 min）。上层清液转入25 mL离心管，下层加5 mL磷酸盐溶液（pH 5）。重复以上操作，合并上清液。

1.3.3 离子液体分散液-液微萃取

将35 μL[Omim][PF6]（萃取剂）和10 μL曲拉通114（抗黏剂）加入至1.3.2节中合并的上清液中，经振荡后超声10 min（55 ℃、频率40 kHz、功率100 W）。乳化后的[Omim][PF6]溶液先置于冰水浴中冷却5 min，而后离心5 min（5 000 r/min），移除上层溶液，用100 μL甲醇溶解沉积在离心管底部的[Omim][PF6]，用0.45 μm微孔滤膜过滤，用微量进样器吸取10 μL进样测定。

2 结果与分析

2.1 萃取溶剂的影响

由于[Bmim][PF6]在水中的溶解度比较大，不易形成乳化的两相系统，本实验考察了[Hmim][PF6]和[Omim] [PF6]的萃取能力，由图1可知，使用[Omim][PF6]且用量为35 μL时萃取效率高。

图1 离子液体的种类（A）和[Omim][PF ]的用量（B）对萃取效率的影响Fig.1 Effects of ionic liquid type (A) and [Omim][PF6] amount (B) on extraction efficiency

2.2 抗黏剂的影响

本实验考察了2 种非离子型表面活性剂-曲拉通100、曲拉通114及其用量对萃取的影响，由图2可知，曲拉通114作为抗黏剂效果较好，且用量为10 μL时萃取效率高。

图2 抗黏剂的种类（A）和曲拉通114的用量（B）对萃取效率的影响Fig.2 Effect of Triton X type (A) and Triton X-114 (B) amount on extraction efficiency

2.3 pH值、离子强度及温度的影响

如图3所示，结果表明，pH值在3.0～8.0范围内，只有在pH值为5.0时，萃取效率最高；当NaCl质量分数从0增加到10%，质量分数为6.0%时萃取效率较高；考察温度从40 ℃增加到65 ℃，由图3C可知，55 ℃时萃取效果最好。

图3 pH值（A）、NaCl的质量分数（B）及温度（C）对萃取效率的影响FFiigg..33 EEffffeeccttss ooff ppHH ((AA)),, iioonniicc ssttrreennggtthh ((BB)),, aanndd tteemmppeerraattuurree ((CC)) oonn extraction efficieennccyy

表1 回收率及精密度实验结果（n=5）Table 1 Results of recovery and precision tests (n = 5)

3 结 论

2.4 方法的线性范围、检出限、精密度和加标回收率

在优化的萃取条件下考察超声辅助的离子液体冷诱导微萃取技术对己烯雌酚萃取的线性范围、检出限（RSN=3）和精密度（n=10），结果见图4，其线性范围为5～300 μg/L，检出限为0.5 μg/L。

图4 萃取方法的标准工作曲线Fig.4 Standard curve established using the extraction method

在阴性牛奶样品中分别添加0.2、0.4、0.8 μg/L 3 个质量浓度水平的己烯雌酚溶液，重复5 次，计算平均回收率和相对标准偏差，由表1可知，方法的平均回收率为93.7%～103.2%，相对标准偏差为2.80%～4.43%。本方法的精密度和重复性令人满意。

本实验建立了离子液体分散液-液微萃取的样品前处理技术，采用高效液相-紫外检测法测定牛奶中己烯雌酚含量的方法。考察了萃取溶剂、抗黏剂、pH值、离子强度及温度对萃取效率的影响。结果表明，使用35 μL [Omim][PF6]、10 μL曲拉通114抗黏剂、pH 5.0、质量分数6.0% NaCl、温度55 ℃时萃取效率较高。对该法进行精密度实验，其平均回收率为93.7%～103.2%，相对标准偏差为2.80%～4.43%。说明该技术可以满足牛奶中己烯雌酚含量的测定。[Omim][PF6]作为萃取溶剂，使该法具有操作简单、环保、萃取效率高和灵敏度高等特点，有很好的应用前景。

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Determination of Diethylstilbestrol in Milk Using Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Followed by HPLC

QI Qi1, HUANG Min2, XIE Haihua1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China; 2. The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

A novel method for the determination of diethylstilbestrol in milk using dispersive liquid-liquid microextraction coupled to high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. Important parameters affecting extraction efficiency, such as extraction solvent type and volume, anti-sticking agent type and volume, pH, salt concentration and temperature, were discussed. Under the optimal conditions, the established method had high sensitivity, low detection limit and high stability for the analysis of diethylstilbestrol. Ultrasound-assisted ionic-liquid cold-induced aggregation dispersive liquid-liquid microextraction could be successfully used for the determination of diethylstilbestrol in milk.

dispersive liquid-liquid microextraction; milk; diethylstilbestrol; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201604036

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0202-04

戚琦, 黄闵, 谢海华. 离子液体分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定牛奶中己烯雌酚[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 202-205.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604036. http://www.spkx.net.cn

QI Qi, HUANG Min, XIE Haihua. Determination of diethylstilbestrol in milk using dispersive liquid-liquid microextraction followed by HPLC[J]. Food Science, 2016, 37(4): 202-205. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604036. http://www.spkx.net.cn

2015-06-16

江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ14654）

戚琦（1971—），女，副教授，硕士，研究方向为光谱学色谱学分析。E-mail：qiqichem@163.com