产腈水解酶基因工程菌的产酶诱导条件及培养基优化

唐璐敏， 薛建萍

上海市农药研究所生物工程中心， 上海 200032



产腈水解酶基因工程菌的产酶诱导条件及培养基优化

唐璐敏， 薛建萍*

上海市农药研究所生物工程中心， 上海 200032

本文通过对产酶诱导条件及发酵培养基进行优化，成功提高了产腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的产酶水平。研究结果显示，最佳发酵培养基为：葡萄糖0.2%、甘油0.7%(v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。最佳产酶诱导条件为：发酵4 h时加入0.5 mmol/L IPTG，然后在28℃、240 r/min下诱导腈水解酶基因表达14 h～16 h。采用优化方案，重组菌产酶水平可提升至0.9～1×105U，与野生菌株的产酶水平相比，提高幅度超过50%。同时重组菌培养仅需 24 h，培养周期缩短超过50 h。

腈水解酶； 重组菌； 诱导优化； 培养基优化

天然腈化物在自然界中广泛存在，很多微生物具备转化腈化物的能力。微生物所产腈水解酶能将多种有机腈催化生成相应的有机酸，这些有机酸在工业、医药等领域具有很高的应用价值，因此近年来关于腈水解酶的研究倍受关注[1-4]。作者单位保藏的一株产腈水解酶菌株Arthrobacternitroguajacolicus可以转化羟基乙腈生产羟基乙酸，已在工业化羟基乙酸生产项目中应用，但与化学法生产羟基乙酸相比，产能优势尚不明显，因此希望通过提高菌株发酵产酶水平来进一步提升产能。研究发现，采用传统诱变方法难以继续提高该菌株的发酵产酶水平，因此开展A.nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆及表达研究，通过酶基因的克隆和异源超量表达来突破瓶颈，进一步提高产能。

作者已克隆到A.nitroguajacolicus的腈水解酶基因，构建了一株产腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit(以下简称为重组菌)[5,6]，但重组酶基因在宿主胞内的表达水平远低于野生菌株的产酶水平，不能满足工业化应用的需求。

通过对该重组菌的酶基因诱导表达条件及发酵培养基配方进行优化，显著提高了重组菌的产酶水平，并缩短了培养周期，优化结果可应用于工业化生产。

在本文研究基础上，另一株基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNitd[基于基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit改造并已申请专利(申请号201510995654.7)]的产酶水平有更大幅度的提高，用于转化羟基乙腈生产乙醇酸具有显著的竞争优势[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

产腈水解酶野生菌株Arthrobacternitroguajacolicus由上海市农药研究所保藏；基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit由上海市农药研究所构建并保藏。

1.1.2 培养基

野生菌种子培养基(g/L)：葡萄糖7.5、蛋白胨5、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5，pH 7.0；发酵培养基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨10、味精0.75、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5、半胱氨酸盐酸盐0.15，pH 7.0。

重组菌种子培养基(g/L)：葡萄糖5、蛋白胨10、NaCl 10、酵母膏5，pH 7.2。

氨苄抗性(Ampr)培养基：培养基中加入终浓度100 μg/μl的氨苄青霉素(Amp)。

1.1.3 主要试剂和仪器

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(简写IPTG)和氨苄青霉素钠(Amp)购自捷瑞生物工程(上海)有限公司；蛋白胨购自南通东海龙生生物制品有限公司，可用OXOID公司胰蛋白胨(tryptone)替代；酵母膏购自广东江门生物技术开发中心有限公司，可用OXOID公司酵母浸粉(yeast extract)替代；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。岛津气相色谱仪GC-2014购自上海纳锘实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活测定

1 mL细胞液或发酵液加入0.05 mL丙烯腈，40℃下振荡反应5 min后加入0.08 mL浓HCl终止反应(反应液pH 1～2)，然后在15 000 r/min下离心5 min，取上清液用气相色谱法测定丙烯酸含量。

酶活计算公式：C样品=C标样×A样品/A标样×60/t，其中C：浓度(μg/mL)；A：峰面积；t：反应时间(min)。

酶活单位( U )定义：1 mL细胞液或发酵液反应1 h产生1 μg丙烯酸为1个酶活力单位。

1.2.2 菌浓测定

取0.2 mL适当稀释的菌液，10 000 r/min下离心2 min，沉淀部分用去离子水等体积重悬，以去离子水为对照测OD600。

1.2.3 菌体培养

1.2.3.1 野生菌培养

种子培养：28 ℃、220 r/min、24 h～48 h，以10%接种量转接入发酵培养基；发酵培养：28 ℃、220 r/min、48 h～72 h。

1.2.3.2 重组菌培养

斜面培养：37 ℃培养16 h～18 h；种子培养：37 ℃、240 r/min，培养4 h～6 h，至OD600为0.6～0.8，以3%接种量转接入发酵培养基；发酵培养：37 ℃、240 r/min下培养一定时间后加诱导剂IPTG，然后在28 ℃、240 r/min下进行酶基因的诱导表达。

1.2.4 重组酶基因的诱导表达条件优化

1.2.4.1 重组菌发酵培养生长曲线

重组菌发酵培养阶段每隔0.5 h～1 h取样测定OD600，绘制生长曲线。根据生长曲线确定诱导剂IPTG的加入时间点。

1.2.4.2 诱导因素优化

分别对IPTG浓度、IPTG加入时的菌株培养时间(以下简称培养时间)，IPTG加入后诱导表达时间这三个因素进行全正交优化试验。放瓶菌液在10 000 r/min下离心5 min收集细胞，去离子水重悬细胞，再次离心收集细胞，再用1mL去离子水悬浮细胞(此细胞液与放瓶菌液相比浓缩了15倍)，测定细胞液酶活。

各因素所取水平为IPTG终浓度 (mmol/L)：0.10、0.25、0.50、0.75和1.00；培养时间(h)：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5(选取范围根据菌体生长曲线测定结果确定)；诱导表达时间(h)：7、15和20。

1.2.5 发酵培养基优化

通过3轮正交试验获得最佳发酵培养基配方。具体内容见结果与讨论部分。

2 结果和讨论

2.1 酶基因诱导表达条件优化

2.1.1 重组菌的生长曲线

重组菌的生长曲线如图1所示。从图中可以看出，2.5 h～5.5 h为菌体生长对数期，此后进入稳定期。2.5 h～6.5 h涵盖了菌体对数生长期和稳定期。

图1 E. coli BL21(DE3)-pETNYNit的生长曲线

2.1.2 诱导表达条件优化

按1.2.4.2的方法试验，酶活测定结果如表1所示。从表中可看出，在重组菌对数生长期的中后期至稳定期的初期加入0.5～1 mmol/L IPTG并诱导表达15 h的效果较好，其中培养5.5 h、加0.5 mmol/L IPTG诱导表达15 h，重组菌产酶水平最高，可达34 939 U，而野生菌株产酶水平在5～6×104U，相比仍有一定差距。

表1 重组腈水解酶的诱导表达条件优化

2.2 发酵培养基优化

2.2.1 正交试验一

据文献报道，以半复合培养基培养重组大肠杆菌可提高菌体细胞密度，培养基中所含无机盐如(NH4)2SO4、NH4Cl等有利于可溶性蛋白的合成[8]。

以重组菌种子培养基为基础培养基，对其中的碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、酵母膏)及无机盐(NaCl)配比进行优化，另外再加入组分(NH4)2SO4和10*M9 salt(10*M9 salt 为含NH4Cl 1%、Na2HPO4·12H2O 8%、KH2PO43%、MgSO4·7H2O 0.25%的盐溶液)，进行3水平正交试验，培养基pH 7.2。试验设计见表2，采用L18(37)正交试验表共18个实验组。

表2 正交试验一的因素和水平设计

注：10*M9 salt水平为v/v%，其他组分水平为w/v%。

先按1.2.3.2的方法培养种子液并转发酵，做重组菌在18组发酵培养基中的生长曲线 ，综合18组生长曲线走势，发酵培养3.5 h的重组菌处于对数生长中前期，4 h则处于对数生长于中后期。根据生长曲线，选定在转发酵培养3.5 h和4 h加IPTG(终浓度0.5 mmol/L)，28 ℃、240 r/min诱导培养过夜(14 h ～16 h)。放瓶方法同2.1.2所述方法，转发酵培养3.5 h加IPTG的正交试验1-1结果及分析见表3、表4；转发酵培养4 h加IPTG的正交试验1-2结果及分析见表5、表6。

表3 正交试验1-1的结果

注：以上表格中的酶活数据未除以浓缩倍数，为浓缩15倍的酶活。

从正交试验1-1的方差分析结果表4看，葡萄糖(因素A)F值最高，为9.490，其他因素的F值都较低，当F0.05(2,2) = 19.00时各因素都无显著性影响，当F0.25(2,2) = 3.00时葡萄糖具有显著性影响。根据表3中的极差分析得到最佳发酵培养基(命名为Ⅰ-1)为：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表4 正交试验1-1的方差分析结果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中显著性以F0.05(2,2)为临界值。

从正交试验1-2的方差分析结果表5看，葡萄糖(因素A)F值最高，为44.343，而其他因素的F值都较低，当F0.05(2,2)=19.00时葡萄糖具有显著性影响。根据表6极差分析得到最佳发酵培养基(命名为Ⅰ-2)为：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表5 正交试验1-2的方差分析结果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中显著性以F0.05(2,2)为临界值。

表6 正交试验1-2的结果

注：以上表格中的酶活数据未除以浓缩倍数，为浓缩15倍的酶活。

Ⅰ-1、Ⅰ-2培养基在蛋白胨含量上有区别，前者为1.5%，后者为1.0%，再次以Ⅰ-1、Ⅰ-2培养基为发酵培养基进行一次实验，每组培养基都分别于转发酵培养3.5 h和4 h加IPTG(终浓度0.5 mmol/L)，进一步验证正交试验结果，同时做对照组(发酵培养基配方与种子培养基配方相同)，结果见表7。

表7 3种发酵培养基的比较

注：表格中的酶活数据未除以浓缩倍数，为浓缩15倍的酶活。

根据表7的结果，正交试验一得到的发酵培养基Ⅰ-1为最优培养基，其组分为：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9 salt 10% (v/v)，pH 7.2。使用此培养基时，重组菌培养条件为：37 ℃、240 r/min种子培养至OD600为0.6～0.8，以3%接种量转发酵；37 ℃、240 r/min发酵培养4 h加入IPTG，IPTG终浓度为0.5 mmol/L；28 ℃、240 r/min诱导培养14 h～16 h。

2.2.2 正交试验二

以发酵培养基Ⅰ-1为基础，进行第二轮发酵培养基优化。从正交试验一的实验结果看，葡萄糖浓度 >0.2%时重组菌的酶活明显降低，原因可能是作为常用碳源的葡萄糖，其含量对大肠杆菌生长有显著影响，存在明显的葡萄糖效应。葡萄糖浓度过高会抑制大肠杆菌的生长。而碳源是菌体产酶必需的营养元素，0.2%的葡萄糖含量无法满足此需求(一般产酶细菌的发酵培养基中葡萄糖含量为1%～2%)，在无法以葡萄糖为碳源的情况下，采用一些非快速利用的碳源来替代葡萄糖。

甘油是一种常见的非快速利用的碳源，在Ⅰ-1培养基中加入不同量的甘油，考察重组菌放瓶发酵液的酶活。培养方法同2.2.1所述最优方法，放瓶发酵液直接按酶活测定方法测酶活，结果见表8。

从表8结果可看出，发酵培养基中加入甘油有助于菌体量及酶活的提高，将甘油与正交试验一中除葡萄糖外的其他组分一起进行正交试验，进一步细化正交试验一各组分的水平，缩小各因素水平范围，培养基中0.2%葡萄糖为确定组分。正交试验采用L18(37)，试验设计和结果如表9、10、11所示。

表8 甘油对重组菌发酵的影响

表9 正交试验二的因素和水平设计

注：10*M9 salt水平为v/v%；甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中体积百分比加入培养基中；培养基中其他组分水平为w/v%。

表10 正交试验二的方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中显著性以F0.05(2,2)为临界值。

从表10看，甘油为显著影响因素，与试验前所做碳源对产酶的重要性分析相符。

在表11的极差分析中，甘油的均值M1(对应水平0.5%)与均值M2(对应水平0.7%)相近且明显高于均值M3(对应水平1.0%)，需做进一步试验确定。其他各组分的M1、M2和M3值都很接近。蛋白胨各水平的均值很接近。考虑到氮源浓度不易过高，以保证培养基的碳氮比适中及控制培养基成本，选用蛋白胨1.2%。10*M9 salt各水平均值接近，呈现出谷形走势而不是峰形走势，选用两端水平点7%和13%做进一步试验确定。除了需进一步确定的因素水平(甘油0.5%或0.7%、10*M9 salt 7%或13%)外，根据极差分析结果确定其他培养基组分为：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。

将需要确定的两个因素的两个水平相互组合，加入已确定的培养基组分配制成以下4组培养基，试验设计和结果见表12、13。

从表13结果看，Ⅱ-1为最佳培养基：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、10*M9 salt 13% (v/v)，pH 7.2。将10*M9 salt中各组分拆分换算得到各组分含量：NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%。

2.2.3 正交试验三

将发酵培养基Ⅱ-1中10*M9 salt的各组分拆分，进行第三轮正交试验优化。同时加入在第二轮优化结果中显示具有显著影响性的甘油，培养基中其他组分为葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。试验设计见表14，采用正交试验表L18(37)。培养方法同2.2.1所述最优方法，放瓶发酵液直接按酶活测定方法测酶活，试验结果及分析见表15、16。

表11 正交试验二的结果

表12 甘油及M9 salt组分含量的确定

表13 甘油及M9 salt组分含量确定的试验结果

注：对照为不加甘油。

从表16可看出，各因素的F值都较低，当F0.25(2,2)=3.00和F0.05(2,2)=19.00时都不具有显著性影响。根据表15的极差分析得到最佳发酵培养基(命名为Ⅲ-1)为葡萄糖0.2%、甘油0.5% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.15%、Na2HPO4·12H2O 1.5%、KH2PO40.8%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.2。

将培养基Ⅱ-1和Ⅲ-1作为发酵培养基进行比较，试验结果见表17。

表17结果显示，Ⅱ-1和Ⅲ-1的发酵产酶效果相近，在无机盐使用量上后者明显高于前者，增加了原料成本，因此仍选Ⅱ-1为最佳培养基。

2.2.4 水质实验

以上发酵培养基优化试验中都是用去离子水配制培养基，为了适应工业化生产，改用自来水配制培养基。用去离子水和自来水分别配制以上优化试验获得的Ⅱ-1和Ⅲ-1培养基，既考察了水质对发酵的影响，又再次比较优化培养基Ⅱ-1和Ⅲ-1。结果见表18。

表14 正交试验三的因素和水平设计

注：甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中体积百分比加入培养基中；其他组分水平为w/v%。

表15 正交试验三的结果

表16 正交试验二的方差分析结果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中显著性以F0.05(2,2)为临界值。

表17 发酵培养基Ⅱ-1和Ⅲ-1对产酶效果

表18 水质对发酵效果的影响

从表18的结果可知，可用自来水替代去离子水配制培养基，用发酵培养基Ⅱ-1和Ⅲ-1的发酵结果相近，结果能重现。确定最优培养基为Ⅱ-1：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，自来水配制，pH 7.2。

经过3轮正交试验，确定了最佳培养基配方及相应培养方法。在优化条件下，重组菌的产酶水平可达(0.9～1)×105U，比野生菌的产酶水平提高了50%以上。

3 结论

通过对产腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的酶基因诱导表达条件及发酵条件进行优化，成功提高了该重组菌的产酶水平。

通过研究获得的最优培养方法为：斜面挑菌接入种子培养基，种子培养至OD600为0.6～0.8时，以3%接种量转接发酵培养基，培养4 h加入0.5 mmol/L的诱导剂IPTG。种子及发酵培养条件均为37 ℃、240 r/min。加入IPTG后，在28 ℃、240 r/min下诱导酶基因表达14 h～16 h。经正交优化所得的最佳发酵培养基为：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。试验同时证明，培养基可使用自来水进行配制。培养基中均含100 μg/mL Amp。

采用最优培养方法，重组菌产酶水平可提升到(0.9～1)×105U，与野生菌株相比提高幅度超过50%。同时重组菌培养仅需 24 h，相比之下，野生菌株培养需72 h～120 h，培养周期大幅缩短。该优化方法在工业生产中能有效提高腈水解酶的产能，具有很高的工业应用价值。

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Optimization of culture conditions for production of nitrilase by using recombinantE.coli

TANG Lu-min, XUE Jian-ping

Biological Engineering Center，Shanghai Pesticide Research Institute，Shanghai 200032, China

In this study, the production of nitrilase by using recombinant strainE.coliBL21 (DE3) -pETNYNit was improved by optimization of induced conditions and fermentation medium. The results indicated that the optimal medium were as follows: glucose 0.2%, glycerol 0.7% (v/v), peptone 1.2%, yeast extract 0.8%, NaCl 0.3%, (NH4)2SO40.3%, NH4Cl and 0.13%, Na2HPO4·12H2O 1.04%, KH2PO40.39%, MgSO4·7H2O 0.03%, pH 7.2; the optimal induced conditions were the following: 0.5 mmol/L IPTG induced expression after fermented for 4 hours, and then cultured for 14 hours to 16 hours at 28 ℃ and 240 r/min. After optimization, the nitrilase activity of the recombinant strain increased to (1～0.9)×105U. Compared with that of the wild strain, the enzyme activity increased by more than 50%. At the same time, the culture time of the recombinant strain was about 24 hours, reduced more than 50 hours.

nitrilase; recombinant strain; induction condition optimization; culture medium optimization

国家高技术研究发展计划(863计划)，课题编号SS2014AA022106。

唐璐敏(1982～)，女，工程硕士。电话：021-64387891-133，E-mail：coriah@126.com。

*通讯作者: 薛建萍(1961～)，女，高级工程师。电话：021-64387891-133，E-mail：xjp54241246@163.com。