混合分子质量壳聚糖结合臭氧杀菌处理对罗非鱼片的冷藏保鲜作用

吴湛霞，潘江球，杨子明，陈 松，黄盛东，李普旺，杨锡洪，李思东

（1.广东海洋大学理学院，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；3.中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东 湛江 524001；4.青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛 山东 266061）

混合分子质量壳聚糖结合臭氧杀菌处理对罗非鱼片的冷藏保鲜作用

吴湛霞1，潘江球2，杨子明3，陈 松1，黄盛东1，李普旺3，杨锡洪4，李思东1

（1.广东海洋大学理学院，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；3.中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东 湛江 524001；4.青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛 山东 266061）

以感官评分、细菌总数、pH、挥发性盐基氮（TVB-N）等作为其保鲜效果的评价指标，研究混合分子质量的壳聚糖结合臭氧杀菌处理对罗非鱼片4℃冷藏保鲜效果的影响。结果表明：混合分子质量壳聚糖结合臭氧水杀菌处理能减少罗非鱼片的菌落总数并抑制细菌的生长繁殖，减缓pH的变化，保持罗非鱼片的感官品质，延缓TVB-N值的升高，延长罗非鱼片的保鲜期，其保鲜效果优于单一分子质量的壳聚糖。

罗非鱼片；冷藏保鲜；壳聚糖；臭氧水

罗非鱼（Tilapia）又名福寿鱼、非洲鲫鱼等，现已成为世界性的养殖鱼类［1-2］。因其水分含量高和营养成分丰富而极易腐败变质，导致罗非鱼及其相关产品的货架期较短，这在一定程度上制约了其养殖业的发展。通过添加保鲜剂仍是延长罗非鱼冷藏货架期的重要途径［3］，安全、高效和低成本是人们对防腐剂提出的新要求。壳聚糖作为一种天然、无毒、无味、高效的生物防腐剂，在食品保鲜领域得到了广泛应用［4-11］。前期研究表明［12］，壳聚糖虽对罗非鱼具有较好的保鲜效果，但保鲜效果的提升仍显有限。

臭氧水具有极强的氧化能力和杀菌消毒能力［13］。利用臭氧水处理鱼肉，不仅可改善罗非鱼片的色泽，还可减少其初始菌落总数，从而延长产品货架期［11-16］。壳聚糖的成膜性、渗透性和抑菌性受分子质量的影响；相对分子质量高的壳聚糖具有更好的成膜特性，而低分子质量的壳聚糖具有更好渗透性和抑菌性［17］。将高低两种分子质量的壳聚糖按不同配比混合制得新型保鲜剂其效果要好于单一分子质量的壳聚糖［18-19］。本研究以罗非鱼片为原料，结合臭氧水杀菌处理，以不同分子质量的两种壳聚糖不同比例混合液作为保鲜剂，探讨其对罗非鱼片的冷藏保鲜品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：新鲜罗非鱼，平均每尾约500 g，购于湛江市沃尔玛超市。

试剂：南通生物兴成制品厂壳聚糖（食品级，分子质量为4 ku、200 ku，脱乙酰度≥90%），sigma公司甲醇（色谱纯），上海源叶生物科技有限公司ATP关联物ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx标准品，其余试剂均为分析纯。

仪器：日本日立HIMAC CR22GII 冷冻离心机，日本岛津公司 LC-20AT高效液相色谱，北京恒瑞天创机电设备有限公司 HR/TYJ-2A 型菌落计数器，上海佑科仪器仪表有限公司 722S型可见光分光光度计，青岛海尔股份有限公司BCD-215KS冰箱，上海博迅实业有限公司BPH-9272型恒温培养箱，上海申安医疗器械厂LDZX-50FBS不锈钢立式压力灭菌器。

1.2 实验方法

1.2.1 不同比例混合壳聚糖抑菌性能的测定 将分子质量分别为4 ku与200 ku壳聚糖配制成质量浓度为10.0 g/L的醋酸溶液（溶剂醋酸溶液的质量浓度为1%）。分别量取0.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0mL分子质量4 ku壳聚糖溶液和100.0、80.0、70.0、60.0、50.0、40.0、30.0、0.0分子质量200 ku壳聚糖进行两两混合，制得4 ku的壳聚糖比率分别为0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、100%（以混合壳聚糖中4 ku壳聚糖体积分数计）的壳聚糖混合液。参照文献［20-22］的方法，测定不同比例混合壳聚糖的抑菌活性。

1.2.2 不同质量浓度臭氧水对罗非鱼初始附生菌菌落总数的影响 将鲜活罗非鱼采用碎冰冰冻至死，去除鳞、头、尾、内脏（“四去”处理）后，用冰水清洗干净，取其背部肉片并切成小块。通过控制臭氧通入冷水的持续时间，制备不同浓度的臭氧水。每份取罗非鱼片20 g，反复使用臭氧水浸泡3次，每次使用臭氧水80mL，浸泡5 min。参考文献 ［23］的方法来测定不同处理罗非鱼片的初始菌落总数。

1.2.3 混合壳聚糖结合臭氧水杀菌处理对罗非鱼的冷藏保鲜效果

1.2.3.1 试样的处理 将鲜活罗非鱼采用碎冰冰冻至死，经“四去”处理后，用冰水清洗干净，取罗非鱼背部肉片，并切成长约为5cm、宽约为3 cm、厚约为1 cm的鱼片。然后混匀、沥干，取出其中500g不做任何处理，作为空白对照组。再将剩余的罗非鱼片浸泡于4L臭氧水中5 min，重复3次。取出其中 500 g，记作臭氧水处理组。最后将剩余的罗非鱼片分为两组，每组均不少于 500 g。将其中一组浸泡于质量浓度为1%、分子质量为4ku的壳聚糖溶液中，记作4 ku壳聚糖组；另外一组浸泡于质量浓度为 1%的混合壳聚糖溶液中，其中分子质量为4 ku和200 ku壳聚糖的比例为2∶3，记作混合壳聚糖组。随后，将各组罗非鱼片滤干并进行真空包装和标记，每个包装袋罗非鱼片的质量约为50 g，然后平铺于 4℃的冰箱中进行冷藏保鲜。在贮藏过程中，每天随机取出袋装样品对其进行感官评分、细菌总数、 pH和挥发性盐基氮（TVB-N 值）的测定。本实验使用的溶液和臭氧水均预先冷却至4℃，臭氧水由臭氧发生器产生的臭氧通入4℃的纯净水5 min所制得的。

1.2.3.2 测定方法 主要测定罗非鱼片在贮存过程中的感官评分值、菌落总数、pH值以及挥发性盐基氮（TVB-N），各指标的测定方法同文献［12］。

2 结果与讨论

2.1 不同比例混合壳聚糖的抗菌性能

分子质量4 ku和200 ku的壳聚糖按不同比例混合后的抑菌圈大小见图1。随着4 ku分子质量壳聚糖比率的逐渐升高，其抑菌圈先增大后减小，当4 ku分子质量壳聚糖的比率为40%时，抑菌圈最大，达到19.7mm，比4 ku分子质量壳聚糖的大11%，比200 ku分子质量壳聚糖的大55%。此时混合壳聚糖的抑菌圈大于单一分子质量的，说明混合壳聚糖的抗菌性可以强于单种分子质量的壳聚糖，更能发挥不同分子质量壳聚糖抗菌性能的优势。有研究表明，高分子质量的壳聚糖易在微生物表面形成一层薄膜，阻碍了微生物的物质转化和呼吸基质的消耗［24，25］；小分子质量壳聚糖具有较强的渗透力，渗入到微生物的细胞体内，扰乱微生物的正常生理活动［26，27］。两种分子质量的壳聚糖混合，可以充分发挥它们各自的优势，从而增强其抑菌效果。

图1 不同比例混合壳聚糖的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of mixed chitosan with different proportion

2.2 臭氧水质量浓度对罗非鱼片菌落总数的影响

由图2可知，随着臭氧通入时间的增加，臭氧水的浓度在增大。用不同浓度的臭氧水处理罗非鱼片，罗非鱼片的菌落总数随着臭氧水浓度的增大而减小。将臭氧通入冷水5 min所制得的臭氧水质量浓度可达4.48 mg/L，用该臭氧水处理罗非鱼片，可将罗非鱼片上附生菌的菌落总数降低至初始值的19.0%。因此可知，将臭氧通入4℃的纯净水5 min所制得的臭氧水用于罗非鱼片保鲜的杀菌预处理方法可行，效果明显。

2.3 混合壳聚糖结合臭氧水杀菌处理对罗非鱼的冷藏保鲜效果

2.3.1 罗非鱼片在冷藏过程中感官评分的变化由图3可知，在整个保鲜过程中，未经壳聚糖处理组别的感官评分相对下降得较快，呈先快后慢的趋势，而经壳聚糖处理后的组别的下降速度则相对较为平缓，表明壳聚糖能有效延缓罗非鱼的腐败变质，延长罗非鱼的冷藏保鲜期。新鲜罗非鱼片可在4℃的条件下保持一级鲜度1 d，二级鲜度3 d。经臭氧水处理后，罗非鱼片的初始菌落总数有所下降，冷藏保鲜期为4 d，比对照组延长了1 d。而罗非鱼片经臭氧水杀菌处理后，配合壳聚糖进行保鲜的效果更佳，均能使罗非鱼片的冷藏保鲜期延长至10 d以上。与4 ku壳聚糖组相比，混合壳聚糖组的感官评分更高，说明混合壳聚糖更能保持罗非鱼的品质，具有更好的保鲜效果。

图2 臭氧水处理对罗非鱼片菌落总数的影响Fig.2 The effect of ozone water on total bacterial count of Tilapia Fillets

图3 罗非鱼片在冷藏过程中感官评分的变化Fig.3 Sensory scores of Tilapia fillets during cold storage

2.3.2 罗非鱼片在冷藏保鲜过程中pH的变化 在死鱼体整个冷藏保鲜过程中，糖原酵解产生乳酸及ATP、磷酸肌酸而使 pH逐渐降低，但达到最小值后，随着鱼体鲜度的下降，氨和胺类化合物的生成，pH又逐渐回升。由图4可知，未经壳聚糖处理的组别的pH变化较快，幅度也较大，而经壳聚糖处理后的组的pH变化则较为平缓，表明壳聚糖能有效延缓鱼体酸性物质和碱性物质的生成，延长罗非鱼的冷藏保鲜期。其次，与空白对照组相比，臭氧水处理组的变化及其变化幅度均较小，说明臭氧水杀菌处理可在一定程度上延长罗非鱼的冷藏保鲜期。与4 ku壳聚糖组相比，混合壳聚糖组的变化速度及其变化幅度较4 ku壳聚糖组小，pH出现的最低值也相对较高，这表明混合壳聚糖更能延缓鱼体酸性物质和碱性物质的生成，具有更佳的冷藏保鲜效果。在整个保鲜过程中，壳聚糖组的pH均低于空白对照组，这可能与醋酸残留于鱼体外表有关，尚需进一步实验证明。此外，pH达到最低值的时间依次是空白对照组、臭氧水处理组、4 ku壳聚糖组和混合壳聚糖组，这表明臭氧水和壳聚糖可在一定程度上延缓pH达到最低值的时间，这可能是由于臭氧水杀菌和壳聚糖处理能延缓糖原酵解产生乳酸、磷酸肌酸等酸性物质。由于酸性物质的生成被延缓了，而碱性物质也一直在生成，因此鱼体pH值的变化速度和变化幅度就变得较为平缓。

图4 罗非鱼片的pH值与贮藏时间的关系Fig.4 pH values of Tilapia fillets during cold storage

2.3.3 壳聚糖浓度对罗非鱼片挥发性盐基氮

（TVB-N）的影响 挥发性盐基氮是通过测定蛋白质在酶和细菌作用下分解产生的挥发性氮等碱性含氮化合物的鲜度指标。随着罗非鱼冷藏保鲜时间的延长、鲜度的下降，其TVB-N值也逐渐升高。TVB-N值越小，说明保鲜效果越好。由图5可知，保鲜效果由劣至好依次为空白对照组、臭氧水处理组、4 ku壳聚糖组和混合壳聚糖组。臭氧水处理组的TVB-N值基本上比空白对照组的小，说明臭氧水杀菌处理可在一定程度上延缓鱼肉的腐败。壳聚糖处理组的TVB-N值均低于空白对照组，说明壳聚糖能有效延缓鱼体蛋白质的分解、变性、腐败，延长罗非鱼的货架期。混合壳聚糖的TVB-N值最小，变化速度也最为缓慢，说明其保鲜效果最好。此外，空白对照组可保持一级鲜度1 d，到4 d时，TVB-N值已达到33.05×10-2mg/g，超过了二级鲜度的阈值（30 mg/100g），而壳聚糖组TVB-N值均没超过二级鲜度的阈值（30 mg/100g），这表明壳聚糖配合臭氧水杀菌处理可延长罗非鱼的冷藏保鲜期至10 d以上。

图5 罗非鱼片的挥发性盐基氮值与贮藏时间的关系Fig.5 Total volatile basic nitrogen（TVB-N）values of Tilapia fillets during cold storage

2.3.4 混合壳聚糖与罗非鱼片菌落总数的关系

随着冷藏保鲜时间的延长，鱼体鲜度的下降，罗非鱼的细菌总数也逐渐增加。罗非鱼片在冷藏保鲜过程中的细菌总数的对数值由大到小依次为空白对照组、臭氧水处理组、4 ku壳聚糖组和混合壳聚糖组。微生物的生命活动是导致水产品腐败变质的主要因素，细菌总数是判断罗非鱼鲜度的重要指标之一。由图6可知，臭氧水处理组可减少罗非鱼的初始菌落总数，并延长罗非鱼的货架期，并且臭氧水杀菌处理配合壳聚糖的保鲜效果更佳。保鲜10 d，壳聚糖处理组菌落总数的对数值仍未超过6。与4 ku壳聚糖组相比，混合壳聚糖组的细菌总数更少，说明其保鲜效果更好。因此，混合壳聚糖能有效抑制微生物的生长繁殖，保持罗非鱼的品质，延长罗非鱼的冷藏保鲜期，配合臭氧水杀菌处理，效果更佳。

图6 罗非鱼片的菌落总数与贮藏时间的关系Fig.6 Total bacterial count of Tilapia fillets during cold storage

3 结 论

混合壳聚糖配合臭氧水杀菌处理能有效抑制细菌的生长繁殖，减缓蛋白质的自溶和分解，保持罗非鱼片的品质，延缓罗非鱼片的腐败变性，延长罗非鱼的保鲜期，且其保鲜效果优于单纯壳聚糖。采用臭氧水杀菌处理并结合混合分子质量壳聚糖处理罗非鱼片的保鲜鲜果要好于单一分子质量的壳聚糖或臭氧水，操作方便、效果好，具有较好的应用前景。

［1］巩育军，郭先霞，李瑞伟，等.罗非鱼营养成分研究进展［J］.中国食物与营养，2009（11）：50-52.

［2］陈胜军，李来好，杨贤庆，等.我国罗非鱼产业现状分析及提高罗非鱼出口竞争力的措施［J］.南方水产，2007，3（1）：75-80.

［3］程琳丽，李来好，马海霞.罗非鱼的保鲜研究进展［J］.食品工业科技，2013，34（11）：372-375.

［4］范文教，孙俊秀，陈云川，等.壳聚糖可食性涂膜冷藏保鲜鲢鱼的研究［J］.江苏农业科学，2011，39（4）：314-316.

［5］王娟慧，谭兴和，熊兴耀，等.壳聚糖涂膜对鲜切马铃薯保鲜效果的影响［J］.食品工业科技，2007，28（8）：215-218； 221.

［6］任邦来，刘鹏.不同浓度壳聚糖处理对辣椒保鲜效果的影响［J］.中国食物与营养，2014，20（4）：39-41.

［7］李瑶瑶，李喜宏，邓玉璞，等.脐橙新型壳聚糖水凝胶抑菌保鲜研究［J］.食品工业科技，2013，34（23）：328-332.

［8］曹雪慧，杨方威，朱丹实，等.壳聚糖复合涂膜对草莓保鲜的影响［J］.食品与发酵工业，2014，40（4）：205-209.

［9］李来好，杨贤庆，黄卉，等.罗非鱼片在冷藏过程中的品质变化研究［J］.食品科学，2010，30（20）：444-447.

［10］贾艳菊，马同锁，刘坤，等.不同壳聚糖抗菌膜对草鱼保鲜效果的比较［J］.中国农学通报，2010，26（3）：337-340.

［11］CAO Rong，LIU Qi，YIN Bangzhong，et al.Chitosan Extends the Shelf-life of Filleted Tilapia（Oreochromis niloticus）During Refrigerated Storage ［J］.Journal of Ocean University of China，2012（3）：408-412.

［12］黄盛东，陈松，潘江球，等.不同分子量壳聚糖对罗非鱼片冷藏保鲜作用的研究［J］.食品工业科技，2015，36（19）：318-321.

［13］郑露，陈昭斌，许欣.臭氧水的制备及其杀灭微生物效果与机制研究现状［J］.现代预防医学，2010，（15）：2918-2919.

［14］郝淑贤，何俊燕，李来好，等.臭氧水对罗非鱼片色泽影响分析［J］.食品科学，2013，34（13）：50-53.

［15］闫师杰，梁丽雅，宋振梅，等.臭氧水对鲶鱼肉保鲜效果的研究［J］.食品科学，2010，31（24）：465-468

［16］施建兵，谢晶，高志立，等.臭氧水浸渍后冰温贮藏提高鲳鱼块的保鲜品质［J］.农业工程学报，2013，29（6）：274-279.

［17］杨冬芝，刘晓非，李治，等.壳聚糖抗菌活性的影响因素［J］.应用化学，2000，17（6）：598-602.

［18］水茂兴，陈美慈.壳聚糖处理番茄、青椒的保鲜效果［J］.浙江农业科学，2001（4）：164-167.

［19］水茂兴，马国瑞，陈美慈，等.壳聚糖添加助剂保鲜草莓的效应［J］.浙江大学学报（农业与生命科学版），2001，27（3）：343-344.

［20］王寿权，赵双枝，张彦昊，等.自制壳寡糖抑菌性能及抑菌机理的初步研究［J］.食品工业科技，2014（3）：218-221.

［21］杨玉红.壳寡糖对大肠杆菌的抑制作用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，（16）：3101-3104.

［22］HANCOCK R E W，LEHRER R.Cationic peptides：a new source of antibiotics ［J］.Trends in Biotechnology，1998，16（2）：82-88.

［23］中华人民共和国卫生部.GB4789.2-2010.食品微生物学检验菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［24］吴迪，蔡伟民.壳聚糖对细菌细胞壁的影响［J］.黑龙江大学自然科学学报，2003，20（3）：101-104；108.

［25］冯小强，李小芳，杨声，等.壳聚糖对细菌细胞膜的影响［J］.食品科学，2009，30（7）：63-67.

［26］郑连英，朱江峰，孙昆山.壳聚糖的抗菌性能研究［J］.材料科学与工程学报，2000（2）：22-24.

［27］宋献周，沈月新.不同平均分子量的α-壳聚糖的抑菌作用［J］.上海海洋大学学报，2000，9（2）：138-141.

（责任编辑：陈庄）

Effect of Different Molecular Weight of Chitosan Mixture Combined with Ozone Water Sterilization on Preservation of Tilapia Fillets During Cold Storage

WU Zhan-xia1，PAN Jiang-qiu2，YANG Zi-ming1，CHEN Song1，HUANG Sheng-dong1，LI Pu-wang3，YANG Xi-hong4，LI Si-dong1
（1.College of science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；3.Agricultural Products Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524001，China；4.College of Chemistry and Molecular Engineering，Qingdao University of Science & Technology，Qingdao 266061，China）

The current study investigated the preservative effects of different molecular weight of chitosan mixture combined with ozone water sterilization for extending the shelf-life of filleted tilapia during refrigerated.The results showed that tilapia fillets treated with mixture chitosan can keep the better sensory score，slow down the change of pH and total volatile basic nitrogen（TVB-N），and decrease total bacteria count，which indicate a better preservative effect.

Tilapia fillets；cold storage；chitosan；ozone water

S983

A

1673-9159（2016）03-0071-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.012

2016-02-19

国家自然科学基金（ 31271938） ； 广东省教育厅创新强校工程项目（ GDOU2013050330，2014KZDXM038）

吴湛霞（1967—），女，实验师，研究方向为海洋应用化学。

李思东（1960—），男，本科，教授，研究方向为海洋应用化学。E-mail： lisidong2210491@163.com