109例尖锐湿疣患者的HPV型别特点分析

包振宇，张云杰，邹先彪，郭晓娟，林　卉

109例尖锐湿疣患者的HPV型别特点分析

包振宇，张云杰，邹先彪，郭晓娟，林卉

目的 了解尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染的型别特点，为疾病的治疗和预后的判断提供理论依据。方法 采用流式荧光-液态芯片技术对109例尖锐湿疣患者（男76例，女33例）进行HPV基因型别检测，分析男女患者感染HPV基因型及感染类型特点。结果 尖锐湿疣患者的HPV DNA阳性检出率为87.16％，阳性检出率前6位的基因型分别为HPV6、HPV11、HPV16、HPV39、HPV18、HPV51。男女患者之间HPV DNA阳性检出率差异无统计学意义；在HPV感染类型方面， 女性多重感染率为78.57％，男性为53.73％，女性明显高于男性（P＜0.05）；在感染型别方面，女性高危型感染率为49.21％，男性为25.20％，女性明显高于男性（P＜0.05）。结论 尖锐湿疣患者感染的HPV以低危亚型、多重感染为主，亦有一定比例的高危型感染。不同性别的尖锐湿疣患者感染HPV的特点有差异，男性患者以低危型别和单一类型感染为主，而女性以高危型别和混合的多重类型感染为主。HPV感染对女性影响要大于男性，要重视对成年女性的HPV的筛查，做到及早发现及早治疗，改善女性的生活质量。

尖锐湿疣；人乳头瘤病毒；基因型检测；性别因素

尖锐湿疣（condyloma acuminata， CA）是以生殖器部位皮肤黏膜的良性增生性损害为主的一种性传播疾病，因高复发率及强传染性使其传播非常广，其发病率仅次于淋病，居于国内性传播疾病的第二位［1］。人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）是其病原体，该病毒目前已被发现约有30余种亚型可以感染生殖道，20余种与肿瘤发展密切相关［2］。根据致病力的不同，又将这30种亚型分为低危型、高危型两种型别，低危型感染常引起皮肤黏膜的良性的疣状增生，如CA等；而高危型的持续性感染可导致感染部位出现非典型增生及恶性变，如宫颈内瘤样变、宫颈癌等。在临床上可发现不同性别CA患者的HPV感染情况有一些差异，但相关的研究资料却不多。本研究利用流式荧光-液态芯片技术对不同性别的尖锐湿疣患者进行HPV基因型进行检测，现将检测结果报告如下。

1 对象与方法

1.1对象 研究对象2015年10月—2016年1月在解放军总医院第一附属医院皮肤科门诊就诊的109名CA患者，在自愿的基础上对这些患者进行HPV基因型别检测，其中男性76例，占69.72％；女性33例，占30.28％。

1.2标本采集 暴露疣体部位，先用生理盐水清洗，再采用试剂盒所提供的专用小毛刷在疣体头部反复摩擦几次，取得脱落细胞，折断毛刷头，放入装有细胞保存液的取样管内，然后放置于4℃的冰箱中等待检测。

1.3实验试剂与仪器 本实验所需的HPV核酸分型检测试剂盒和通用型引物、β-globin PCR 引物（具体基因序列见文献［3］）和多功能流式点阵仪（Luminex100），均购自于上海透景生命科技有限公司。基因扩增仪（Eppendorf Mastercylcer Gradient）由杭州博日公司提供。

1.4实验步骤

1.4.1样本DNA的提取 取待测标本200 μl，置于高速离心机上，12 000 r/min离心5 min，弃上清，在沉淀液中加DNA提取液200 μl充分混匀，100 ℃恒温处理10 min，再次12 000 r/min离心5 min，取上清5 μl行PCR。

1.4.2PCR试剂配制 取出PCR相关试剂，根据说明书配制反应体系混合液（每个反应体系总体积为20.8 μl，包括5 μl核酸模板、10 μl预混液、 5 μl引物混合液、 0.8 μl聚合5种物质），然后使用移液枪将反应体系混合液按照15 μl/管分别装入各个PCR反应管中。

1.4.3PCR扩增 将提取出的样品核酸按5 μl/管的量逐一加入到相应的PCR反应管中，以2000 r/min的转速离心10 s，然后将PCR反应管放入PCR仪，设定好热盖功能，并按照以下的热循环条件进行扩增，反应条件为： 95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，进行5个循环；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃ 3 min，1个循环。

1.4.4核酸杂交 取微球杂交液，以每孔22 μl的剂量加入到杂交板的微孔中，再从待测样本中抽取PCR扩增产物3 μl依次加入到上述的杂交孔中，并剪取相应大小的透明封口膜覆盖封口；将杂交板再次置于PCR仪进行变性和杂交，基本过程如下：95 ℃ 5 min；变性；48 ℃ 30 min；杂交；48 ℃ 15 min，孵育；然后取下封口膜，再在每个微孔中加入藻红蛋白标记的链霉亲合素75 μl，然后在48 ℃继续孵育15 min。

1.4.5上机检测 将微孔杂交板快速转移至预热好的多功能流式点阵仪，电脑读取微球编码及其对应的荧光强弱信号［4］，经配套分析软件判读检测结果。阳性内对照珠蛋白的信号＞150即代表实验成功，任何HPV型别特异性探针的信号＞150，且≥ 2.5倍背景信号值，即判断为该探针对应的亚型阳性。

1.5统计学处理 用SPSS 17.0软件进行统计分析，2组间计数资料比较用四格表χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HPV DNA检测阳性率及基因分型 109例CA患者参加检测，检出HPV DNA阳性95例，阳性率为87.16％。在本次实验中，共检测出了20种亚型，其中低危型有5种，包括HPV6、11、40、43、61；高危型有15种，包括HPV16、18、31、33、35、39、51、52、53、56、58、59、66、68、82。阳性率前6位感染亚型分别为HPV6、HPV11、HPV16、HPV39、HPV18、HPV51，见表1。

表1　患者HPV基因型Table 1 Distribution of infected HPV gene subtypes

2.2感染类型 95例HPV检测阳性的病例中，单一型感染的有37例，占38.95％（37/95），多重感染58例，占61.05％（58/95）。感染类型分布情况见表2。

表2　患者感染类型Table 2 Infectious types of patients

单一型别感染的37例中，主要的型别为HPV6有23例，占62.16％；HPV11为5例，占13.51％；HPV18和HPV16各2例，均占5.41％；而HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV61各有1例，均占2.70％。在多重型别感染的58例中，其中二重感染有34例，占58.62％，主要基因型为HPV6+11 20例；三重感染18例，占31.03％，主要基因型为HPV6+11+16、HPV6+11+31、HPV6+11+39、HPV6+11+51、HPV6+16+39各2例；而四重以上感染共有6例，占10.34％，基因型分别为HPV6+11+16+18、HPV6+11+18+39、HPV11+16+18+53、HPV11+40+43+61、HPV6+11+39+52+68和HPV6+11+31+35+51+58。

2.3男女感染情况 95例HPV DNA阳性患者中，男性阳性率为88.15％（67/76），女性阳性率为84.84％（28/33），男女阳性率差异无统计学意义（χ2=0.225，P=0.635）。在感染类型方面，男性单一感染率为46.27％（31/67），多重感染率为53.73％（36/67），女性单一感染率为21.43％（6/28），多重感染率为78.57％（22/28），女性多重感染率高于男性（P＜0.05），见表3。在感染型别方面，男性高危型感染率为25.20％（31/123），低危感染率为74.80％（92/123）；女性高危型感染率为49.21％（31/63），低危感染率率为50.79％（32/63），女性高危型感染率高于男性（P＜0.05），见表4。

表3　男女患者感染类型比较（例）Table 3 Comparison of the infectious types between the male and female（cases）

表4　男女患者感染型别比较（例）Table 4 Comparison of the clinical types between the male and female（cases）

4 讨 论

CA的病原体是HPV，它是一种球形DNA病毒，具有严格的嗜上皮特性，不感染其他动物，人是其惟一的宿主，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。根据病毒的基因组特征进行分类，目前已分离出130多种基因亚型，其中有30余种可以感染生殖道，20余种与肿瘤发展密切相关［2］。根据致病力的不同可分为高危型和低危型。有国外研究表明，90％的生殖器疣是由HPV低危型中的HPV6和HPV11型所引起的，约73％的宫颈癌的发生与高危型中的HPV16和HPV18型有关［5］。本研究对27种常见的HPV基因型进行检测，其中低危型10种、高危型17种，包含了能引起生殖器疣的常见HPV类型。

在本次研究中，入组的109例CA患者参加了HPV基因型别检测，检出HPV DNA阳性患者95例，阳性率为87.16％；这与曹嬿等［6］所得结果基本一致。对14例阴性病例进行病理检查，均有典型凹空样细胞，且发病前均有CA患者的亲密接触史，可以诊断为CA，其检测阴性的原因可能为：①本研究取材的为疣体部位脱落细胞，由于刷取的部位不同，其脱落细胞的病毒载量亦不同，可能会影响检测的结果；②与CA有关的HPV基因型有40余种，在本实验中仅检测27种，而这些阴性患者的感染的基因型或不在这27种之中；③由于误差（如实验仪器自身的系统误差等）导致出现的假阴性。

HPV感染与患者性别因素的关系非常密切，在不同性别上的发病率有明显不同。国内一项针对3489例CA患者的流行病学调查显示，男性患者的发病率明显高于女性患者，但女性的HPV检出率却高于男性［7］，这可能与女性生殖道（阴道、宫颈等）特殊的生理构造有关，女性生殖道经常处于潮湿状态，易致HPV感染。但在本研究中，二者之间的阳性检测率却无显著差异，考虑可能与样本量较少有关。本研究结果表明，CA患者感染的基因型以低危HPV6、11为主，男性患者低危型别感染率达到74.80％，明显高于女性的50.79％，而高危型别的感染情况正相反，女性患者感染率为49.21％，高于男性的25.20％，基因型以HPV16、18、39为主，这与Potocnik［8］所得出的结果基本一致。而在HPV感染的类型中，女性患者以混合的多重感染为主，而男性患者感染则以单一型别为主。HPV的感染不仅能引起皮肤黏膜的良性增生，也与肛门癌、阴茎癌、阴道癌、宫颈癌等恶性病变有关，目前已经证实，持续性高危型HPV感染是引起宫颈癌的常见病因之一，以上结果说明，HPV感染对女性影响要大于男性，因此要将成年女性做为高危型HPV感染的易感人群，更要重视女性CA患者的HPV筛查检测，加强HPV 感染的预防和健康教育，预测恶性病变的发生和发展，指导临床采取有效的治疗措施，改善女性患者的生活质量。

［1］ Lu YG， Yang YD， Wu JJ， et al. Treatment of perianal condylomaacuminate with topical AL-PDT combined with curettage:outcome and safety ［ J ］ . Photomed Laser surg， 2012， 30（3）:186-190.

［2］ Li N， Franceschi S， Howell-Jones R， et al.Human papilloma virustype distribution in 30， 848 invasive cervical cancers worldwide:variation by geographical region， histological typeand year of publication ［J］. Int J Cancer， 2011， 128（8）:927-935.

［3］ 李明，邓芳，张扬，等. 应用 Luminex 液相芯片技术检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒基因型 ［J］.安徽医学，2014，18（11）:2083-2086.

［4］ 谢冲，王国民. Luminex 液相芯片的发展及应用［J］.复旦学报（医学版），2012，37（2）:241-244.

［5］ Géraldine DF， Catherine C， Samantha AT， et al. Impact of human papilloma virus-related genital diseases on quality of life and psychosocial wellbeing: results of an observational， health-related quality of life study in the UK［J］. Bmc Public Health， 2013， 13（1）:1-11.

［6］ 曹嬿，邵馨，耿建祥，等. 278例肛门及肛管尖锐湿疣组织HPV感染基因型的研究［J］.国际检验医学杂志，2014，35（8）:969-970.

［7］ 杨戈，林昭春，杨建文. 3489例尖锐湿疣流行病学分析［J］.中国艾滋病性病， 2007，13（2）:143-145.

［8］ Potocnik M， Kocjan B， Seme K， et al. Distribution of human papillomavirus （ HPV） genotypes in genital warts from males in Slovenia［J］. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat， 2007，16（3）:91-98.

［9］ Boshart M， Gissmann L， Ikenberg H， et al. A new type of papillomavirus DNA， its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervicalcancer［J］. EMBO J， 1984，3（5）:1151-1157.

（2016-04-21收稿 2016-06-29修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 张云辉）

Analysis of HPV type characteristics in 109 patients with condyloma acuminatum

BAO Zhen-yu， ZHANG Yun-jie， ZOU Xian-biao*， GUO Xiao-juan， LIN Hui
Department of Dermatoloy， the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing 100048， China

， E-mail: xbzou@126.com

Objective To analyze the characteristics of HPV genotypes of patients infected with condyloma acuminatum （CA）and provide theoretical basis for the treatment and prognosis of diseases. Methods HPV genotype was detected by flow cytometry in 109 CA cases （76 males and 33 females）， and the characteristics of HPV genotype and infection type were analyzed. Results The HPV positive rate of CA patients was 87.16％. The main subtypes were HPV6， HPV11， HPV16， HPV39， HPV18 and HPV51. There were no statistically significant differences in the positive rate of HPV between male and female patients （P＞0.05）； In HPV infection types， the multiple infection rate was 78.57％ in female， 53.73％ in male， and the multiple infection rate of female was significantly higher than that in male （P＜0.05）； In HPV infection genotypes， infection rate of high-risk type was 49.21％ in female， 25.20％ in male， and female’s was significantly higher than that in male （P＜0.05）. Conclusions The HPV of patients with CA is mainly low-risk and multiple infection， and there is a certain proportion of high risk type. There are differences in the characteristics of HPV infection among patients with different genders. The infection of male patients is mainly low-risk and single type， and the infection of female patients is mainly high-risk and mixed multiple types .This shows that the impact of HPV infection on women is greater than that of men， so it is necessary to pay much attention to the HPV screening of adult women and to improve their life quality by early detection and early treatment.

condyloma acuminatum； human papilloma virus； genotype detection； gender factor

R752.5

A

1007-8134（2016）05-0276-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.005

100048 北京，解放军总医院第一附属医院皮肤科（包振宇、张云杰、邹先彪、郭晓娟、林卉）；024000 武警赤峰市森林支队卫生队（包振宇）

邹先彪，E-mail: xbzou@126.com