丹红注射液对兔主动脉动脉粥样硬化斑块内脂联素表达的影响

于志伟　姚晓伟　潘军强

陕西省人民医院心内二科(西安710069)



丹红注射液对兔主动脉动脉粥样硬化斑块内脂联素表达的影响

于志伟姚晓伟潘军强

陕西省人民医院心内二科(西安710069)

目的：观察丹红注射液对兔动脉粥样硬化斑块内脂联素表达的影响。方法：新西兰兔36只，随机分为高胆固醇饮食加丹红注射液组、高胆固醇饮食组及对照组。喂养12周后处死实验兔，取出实验兔主动脉，观察脂联素在各组兔主动脉内膜中的表达。结果：内膜厚度、内膜/中膜厚度比、斑块面积/血管内膜面积均在高胆固醇饮食组最高，高胆固醇饮食加丹红注射液组次之，对照组最低，组间比较差异有显著性(P<0.05)；免疫组化染色及Western blot结果均提示动脉粥样硬化斑块内脂联素蛋白表达在对照组最高、高胆固醇饮食加丹红注射液组次之、高胆固醇饮食组最低，组间比较差异有显著性(P<0.05)。结论：丹红注射液可上调高脂饮食所致动脉粥样硬化兔主动脉粥样硬化斑块内脂联素蛋白的表达，进而抑制动脉粥样硬化的发展。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)及其相关疾病是临床常见病、多发病，随着老龄化社会的发展，其致残率逐步上升，同时也是世界公认的人类主要死亡原因[1]。脂联素(Adiponectin，APN)是由脂肪组织分泌的一个与胰岛素抵抗密切相关的细胞因子，动物实验证实其具有延缓动脉粥样硬化发生、发展的功能[2]。丹红注射液主要由两种传统中药材丹参和红花的有效成分组成，具有活血化淤、通经舒络的功效[3]，动物实验证实其可延缓、抑制家兔AS发生、发展。本研究拟从分子生物学角度探讨丹红注射液对兔动脉粥样硬化斑块内ANP表达的影响。

1材料1.1实验动物模型的建立及主动脉标本的留取自西安交通大学实验动物中心购买新西兰兔36只，兔龄2个月,体重1.5～2.0kg，均为雄性。将实验兔随机分为：高胆固醇饮食加丹红注射液组(A组)、高胆固醇饮食组(B组)及对照组(C组)，每组均为12只。对照组饲喂正常饲料150 g/d；高胆固醇饮食者饲喂高胆固醇饲料(购自西安交通大学实验动物中心)150 g/d；高胆固醇饮食加丹红注射液组给予高胆固醇饲料150g/d+丹红注射液15ml/kg/d(经耳缘静脉注射)。各组实验动物均喂养12周后处死，取出主动脉，去除血管外组织，生理盐水冲洗后用中性甲醛液固定。

1.2实验仪器及试剂脂联素抗体(Anti-Adiponectin)，购自北京博奥森生物技术有限公司。步长制药有限公司提供丹红注射液(20ml/支)。免疫酶标组织化学染色检测试剂盒购自武汉转导生物科技发展有限公司。光学显微镜(BX-51型)OLYMPUS，Japan。病理图文分析系统 PIPS2000(重庆天海医疗设备有限公司)。

2试验方法 2.1免疫组化特异性染色APN蛋白的表达阳性为血管壁染成棕黄色。免疫组化染色后用显微镜显影系统自动采集图像，随机取6个视野(×400)，系统自动测量并计算出阳性信号积分光密度(A值)。

2.2Western-blot法测定主动脉APN蛋白组织溶浆后先提取总蛋白，后用BCA试剂盒测定蛋白总浓度。总蛋白50ug/孔上样，行SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白后转膜，加入一抗(1：500鼠抗兔ANP单克隆抗体或者1：1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育过夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1:1000稀释)4℃孵育过夜。应用凝胶扫描成像系统中进行扫描分析，以β-actin作为内参。

3结果3.1三组间动脉粥样硬化程度的比较 用内膜厚度(μm)、内膜/中膜厚度比(%)、斑块面积/血管内膜面积(%)观察动脉粥样硬化程度。通过比较发现：内膜厚度(μm)、内膜/中膜厚度比(%)、斑块面积/血管内膜面积(%)均在高胆固醇饮食组(A组)最高，高胆固醇饮食加丹红注射液组(B组)次之，对照组(C组)最低，组间比较差异有显著性(P<0.05)，见表1。

表1　三组间动脉粥样硬化程度的比较

注:与B组及C组相比*P<0.05；与C组相比△P<0.05

3.2免疫组还染色观察三组间APN的表达通过免疫组化染色发现兔动脉粥样硬化斑块内脂联素蛋白在高胆固醇饮食组(A组)、高胆固醇饮食加丹红注射液组(B组)、对照组(C组)的表达A值分别为：0.265±0.035、0.446±0.064、0.843±0.083，组间比较差异有显著性(P<0.05)，见图1。

图1　主动脉AS斑块脂联素蛋白的表达(×400)

3.3Western blot检测三组间AS斑块内APN的表达Western blot检测三组间AS斑块内APN的表达，发现AS斑块内APN蛋白表达分别为：高胆固醇饮食组(A组)最低为(0.265±0.015)，高胆固醇饮食加丹红注射液组(B组)次之为(0.863±0.083)，对照组(C组)最高为(1.510±0.273)，组间比较差异有显著性(P<0.05)，见图2。

图2　三组间联素蛋白Western blot检测结果比较

4讨论APN是由成熟脂肪细胞分泌出一种蛋白质，因其具有抗炎、保护血管内皮、改善胰岛素抵抗及动脉粥样硬化发展等生物学活性，故又有“内源性生物活性多肽”之称[4]。我们前期的研究结果提示APN在高脂饮食所致动脉粥样硬化兔主动脉斑块内表达明显减低，验证了其在抗动脉粥样硬化中的作用[5]。丹红注射液是由传统中药丹参、红花有效提取物的主要成分组成的复合剂，其主要成分为丹参酮、丹参素、红花黄色素、红花苷等[6]。传统医学认为丹红注射液具有活血化淤、通经舒络之功效。现代医学研究证实：丹红注射液具有降低血脂、抑制血小板聚集、改善内皮功能等作用，从而在临床上广泛用于心、脑血管疾病及外周血管等疾病的治疗[7]。

高脂饮食所致兔严重动脉粥样硬化模型是经典的研究动脉粥样硬化及其相关疾病发病机制、治疗方法的实验模型[8]。此次研究发现高脂饮食所诱发严重AS发生，而高胆固醇饮食加丹红注射液组内膜厚度、内膜/中膜厚度比、斑块面积/血管内膜面积均显著低于高胆固醇饮食组，这说明丹红注射液具有明显抑制高脂血症所致动脉粥样硬化发生、发展的作用。此外本研究从分子生物学角度出发，利用免疫组化技术及Western blot技术，更深层次探讨了丹红注射液在抗动脉粥样硬化中的

作用，发现：高胆固醇饮食加丹红注射液组主动脉动脉粥样硬化斑块内APN的表达显著高于高胆固醇饮食组。这提示：丹红注射液除了通过降低血脂、抑制血小板聚集、改善内皮功能等抗动脉粥样硬化机制之外，其可能通过上调APN的基因表达从而抑制炎症反应、改善胰岛素抵抗，进而在抗动脉粥样硬化中发挥重要作用。至于丹红注射液在动脉粥样硬化过程中上调APN的确切机制有待于进一步研究。

[1]Ho SS.Current status of carotid ultrasound in atherosclerosis[J]. Quant Imaging Med Surg, 2016 ,6(3):285-296.

[2]Caselli C. Role of adiponectin system in insulin resistance[J]. Mol Genet Metab,2014,113(3):155-160.

[3]丹红注射液对介入治疗ST段抬高型急性心肌梗塞的疗效观察[J].陕西中医,2014,35(6):648-650.

[4]Skurk C, Wittchen F, Suckau L,et al.Description of a local cardiac adiponectin system and its deregulation in dilated cardiomyopathy[J]. Eur Heart J,2008,29(9):1168-1180.

[5]潘军强,姚晓伟,周鑫，等. 盐酸吡咯列酮对动脉粥样硬化兔主动脉脂联素表达的影响[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2014, 35(2):227-230.

[6] 付婵, 罗娟敏, 王义明，等.多波长高效液相色谱法同时测定丹红注射液中7种成分含量[J]. 中国新药杂志,2012,21(23):2817-2820.

[7]Lv Y, Pan Y, Gao Y, et al.Effect of Danhong Injection Combined with Naoxintong Tablets on Prognosis and Inflammatory Factor Expression in Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Percutaneous Coronary Intervention[J]. Zhonghua Minguo Xin Zang Xue Hui Za Zhi, 2015,31(4):301-307.

[8]Dornas WC, Oliveira TT, Augusto LE, et al. Experimental atherosclerosis in rabbits[J]. Arq Bras Cardiol, 2010,95(2):272-278.

(收稿2016-04-17；修回2016-05-18)

*陕西省社会发展攻关项目资助(2004K17-G22)

脑脉粥样硬化脂联素@丹红注射液动物，实验兔

R743.1

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.082

∆陕西省富平县人民医院(富平711700)