氨基酸修饰可食用生物膜载体的制备与性质

孙　也，王艳萍，李淑雅，刘兆贤，刘　媛*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

氨基酸修饰可食用生物膜载体的制备与性质

孙也，王艳萍，李淑雅，刘兆贤，刘媛*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

为拓展乳酸菌生物膜在食品领域的应用，构建可食用型高分子载体，本实验以可介导乳酸菌黏附的氨基酸为配体，将其修饰在海藻酸钠材料上，通过核磁共振技术、氨基酸含量、ζ电势和水接触角等物理量表征载体性质，培养马奶酒样乳杆菌ZW3，研究载体对乳杆菌生长和胞外多糖分泌的促进作用。结果显示：培养4 d后，精氨酸修饰载体表面乳杆菌数量达到3.8×107CFU/cm2，是赖氨酸修饰载体的3.5 倍；同时胞外多糖分泌量达到28.2 μg/cm2，是赖氨酸修饰载体的2.4 倍。与赖氨酸修饰载体相比，精氨酸修饰载体更有利于乳杆菌的生长和胞外多糖的分泌。该结果表明可以通过配体种类的选择促进乳酸菌生物膜的形成。

氨基酸；海藻酸钠；生物膜；乳酸菌；配体

细菌生物膜由于菌体间特殊的排列结构和胞外聚合物的保护作用，能使细菌更好地生存和适应环境。与游离状态的细菌相比，生物膜形式的细菌具有更好的系统稳定性和对一些不利环境的抗逆性［1］。乳酸菌作为有益菌中重要的一类，具有良好的发酵特性、食品保藏性能、营养价值和保健作用［2］。研究证明乳酸菌生物膜形式可提高发酵产率和体系稳定性［3-4］，增加对不良因素的耐受性等［5-6］。如果能将乳酸菌以生物膜的形式添加到食品中，必将在改善人类健康方面发挥更大的作用［7］。

为形成高效稳定的乳酸菌生物膜，除培养条件的调控外，最重要的是载体性质对生物膜形成的诱导作用。这是由于生物膜的形成起始于菌表面黏附素与材料表面的黏附，进而分泌胞外聚合物将自身包绕其中而形成。然而，目前研究所使用的载体多为商业化产品，如玻璃、陶瓷片、不锈钢和塑料等［8-11］。该类载体多为非可食用型材料，其结构性质限制了乳酸菌生物膜在食品添加领域的应用。

一些小分子物质可以介导乳酸菌的黏附，如单克隆抗体、抗生素和氨基酸［12-15］等。其中，氨基酸类配体生物相容性好、食用安全、结构易于修饰，最重要的是不会对乳酸菌的活性造成负面影响。因此，本研究将氨基酸（精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys））修饰在天然高分子材料海藻酸钠上，培养马奶酒样乳杆菌ZW3，考察生物膜形成情况。研究结果将为乳酸菌生物膜更广泛地应用于食品领域提供实验数据和理论基础。

1　材料与方法

1.1菌种

马奶酒样乳杆菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）分离自西藏灵菇，为本实验自主分离、保藏菌种。保存于-80 ℃，改良MRS培养基30 ℃活化2 代即可使用。

1.2试剂与培养基

海藻酸钠（sodium alginate，Alg） 天津市博迪化工有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 北京伊诺凯科技有限公司；精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐、3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，A P T E S） 美国S i g m a公司。2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic Acid，MES）、浓硫酸、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）等试剂均为分析纯。

改良MRS培养基：乳糖4 g、葡萄糖16 g、酵母浸粉45 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸锰0.2 g、氯化钠0.1 g、半胱氨酸盐酸盐1 g、乙酸钠15 g、吐温-80 1 g，pH 6.2，蒸馏水定容至1 L，115 ℃高压灭菌20 min。

1.3仪器与设备

Multiskan GO酶标仪 芬兰Thermo Fisher Scientifi c公司；Avance III核磁共振波谱仪 德国Bruker公司；JY-82水接触角仪 北京哈科试验仪器厂；Mastersizer 3000激光粒度仪 英国Malvern公司；SU-1510扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.4方法

1.4.1氨基酸修饰海藻酸钠的制备

将250 mg海藻酸钠溶解于50 mL MES缓冲液（pH 6.5）中，冰水浴条件下加入125 mg EDC和75 mg NHS活化30 min，加入300 mg赖氨酸盐酸盐或250 mg精氨酸盐酸盐，用1 mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值至7.5，避光反应24 h。将反应液对水透析72 h，冻干，得到氨基酸修饰海藻酸钠材料。

1.4.2氨基酸修饰海藻酸钠的表征

海藻酸钠（A l g）、精氨酸修饰海藻酸钠（Alg-Arg）和赖氨酸修饰海藻酸钠（Alg-Lys）的材料结构与组成通过核磁共振进行检测（400 MHz，D2O）。氨基酸含量通过水合茚三酮法进行测定，检测波长570 nm。将材料配成1 mg/mL的溶液后，采用激光粒度仪测定ζ电势。

1.4.3载体的固载

将圆形盖玻片（直径15 mm）依次用无水乙醇、丙酮、双蒸水超声清洗10 min，110 ℃烘干。将烘干的盖玻片浸泡在50 mL新鲜配制的食人鱼溶液（V（H2O2）∶V（浓H2SO4）=3∶7）中，30 min后用大量水洗至中性，110 ℃烘干冷却至室温。将盖玻片浸入质量分数为2%的 APTES无水丙酮溶液中2 h，依次用无水丙酮、乙醇、双蒸水超声清洗，烘干，冷却至室温待用。

将1 g/100 mL的Alg、Alg-Lys和Alg-Arg分别溶于MES缓冲液中，以1.4.1节相同的方法进行EDC、NHS活化，加入到盖玻片上，反应24 h，用蒸馏水清洗，37 ℃烘干待用。

1.4.4载体亲疏水性的表征

固载有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的载体，其亲疏水性以载体水接触角为表征，通过静态水接触角仪进行测定。

1.4.5乳杆菌生物膜的形成

将固载有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的载体放置在24 孔板中，紫外照射灭菌。将培养至稳定期的马奶酒样乳杆菌ZW3以体积分数1%的接种量添加到新鲜的改良MRS培养基中［16］，1 mL/孔接种到载体上，每2 d更换新鲜的培养基，30 ℃厌氧培养2、3、4 d后用磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，MTT染色，孵育4 h后用二甲基亚砜溶解，酶标仪490 nm波长处检测吸光度。

通过涂板计数活菌数量；将菌液梯度稀释，以相同方法进行MTT染色，以活菌数-吸光度标准曲线计算载体表面活菌数。

1.4.6生物膜胞外多糖分泌量的检测

将厌氧培养至2、3、4 d的生物膜分别用PBS清洗，每孔加入200 μL蒸馏水、100 μL 6%苯酚溶液和500 μL浓硫酸，静止10 min，25 ℃摇匀20 min，用酶标仪于490 nm波长处检测吸光度，扣除胞内多糖吸光度。以葡萄糖溶液含量-吸光度标准曲线计算载体表面多糖分泌量。

1.4.7生物膜形态的观察

将培养至4 d的生物膜用PBS清洗，加入2.5%戊二醛溶液固定30 min，PBS清洗2 次，室温晾干，喷金，电子显微镜观察形貌。

1.4.8数据统计分析

2　结果与分析

2.1氨基酸修饰海藻酸钠的制备及表征

氨基酸修饰海藻酸钠核磁对比谱图如图1所示，Alg核磁谱图中δ3.5～4.0为Alg糖环上氢的吸收峰，而Al-Arg和Alg-Lys谱图中δ1.5～2.0、2.8～3.0分别出现氨基酸上亚甲基氢的吸收峰［17］，说明材料合成成功。

图1　海藻酸钠（A）与精氨酸修饰海藻酸钠（B）、赖氨酸修饰海藻酸钠（C）核磁共振对比谱图Fig.1　1H NMR spectra of Alg （A）， Alg-Arg （B） and Alg-Lys （C）

通过水合茚三酮法检测制备材料的氨基酸含量，结果如表1所示，Alg中未发现含有氨基酸，而Alg-Arg和Alg-Lys中氨基酸含量较为接近，均约为17%。研究表明材料的表面电荷会对细菌黏附造成影响［18］。通过与Alg相比，发现Alg-Arg和Alg-Lys的ζ电势均显著提高，这是由于Arg和Lys均为碱性氨基酸，通常情况下容易带正电荷。但Alg-Arg和Alg-Lys材料总体仍呈负电性，两修饰材料电势无明显差异，可在同等水平上进行载体固载。

表1　海藻酸钠与修饰海藻酸钠氨基酸含量及ζ电势Table1　Amino acid contents and zeta potentials of Alg， Alg-Arg and Alg-Lys

2.2载体的固载及表征

由于氨基酸修饰海藻酸钠材料为水溶性材料，为便于研究，本实验将其固载于玻璃载体上进行后续性质研究，反应过程如图2所示。

图2　载体固载示意图Fig.2　Schematic diagram of carrier immobilization

表2　海藻酸钠与修饰海藻酸钠载体水接触角Table2　Water contact angles of Alg， Alg-Arg and Alg-Lys carriers

除表面电荷，载体的亲疏水性也会对细菌黏附造成影响［18］。因此，通过比较修饰载体的水接触角发现（表2），Alg-Arg和Alg-Lys的水接触角较Alg降低，这是由于Arg和Lys分别含有胍基和氨基等极性基团，均为亲水性氨基酸。该结果说明材料固载成功，且两者间无显著差异，不会对细菌生物膜的形成产生影响。

2.3生物膜形成

马奶酒样乳杆菌ZW3为本课题组自主分离自西藏灵菇的新菌种，其形成生物膜的性质还未被研究。通过静态厌氧培养，乳杆菌ZW3可在Alg-Arg和Alg-Lys载体表面黏附，并持续生长，而在Alg载体表面则无生长（图3）。培养2 d后3 种载体表面的活菌数量无显著差异，这可能与菌株ZW3生长周期较长（2 d）有关。3 d后Alg-Arg、Alg-Lys载体表面活菌数量显著提高，以Alg-Arg载体最为突出，活菌数是Alg载体的2.3 倍。而4 d后，Alg载体表面活菌数量下降，这说明Alg载体可能不是乳杆菌ZW3生物膜形成的适宜载体。已有文献报道亲水性阴离子载体与某些细菌的结合能力较弱［19］；而Alg-Arg和Alg-Lys载体表面活菌数量持续上升，说明乳杆菌ZW3可能在载体表面形成了生物膜结构，促进了菌体的生长。其生长趋势与卢志山等［20］报道的粪肠球菌生物膜菌体生长情况一致。其中Alg-Arg的优势仍然最为明显，活菌数是Alg载体的3.5倍，达到3.8×107CFU/cm2，也与王坤等［21］报道的混菌不锈钢网布密度相近。

图3　不同载体表面乳杆菌数量Fig.3　Amounts of ZW3 adhered to different carriers

Jin Yinjia等［14］曾报道Arg和Lys修饰的磁性纳米粒子都能和革兰氏阳性菌（芽孢杆菌）快速结合，10 min内可富集107CFU/mL。但本研究结果显示Arg修饰载体在乳杆菌ZW3生物膜形成能力上明显优于Lys修饰载体。这可能是由于结合只是生物膜形成初期的关键一步［22］，表现为Alg-Arg和Alg-Lys载体表面早期（2 d）菌体数量无显著差异。而形成稳定的生物膜还取决于多种因素（如胞外多糖、蛋白的分泌等）的共同影响，进而导致后期（3～4 d）产生显著差异。为验证这一推测，本研究又进行了胞外多糖分泌量的测定。

2.4生物膜胞外多糖分泌量

图4　不同载体表面乳杆菌多糖分泌量Fig.4　Secretion amounts of exopolysaccharide on different carriers

乳杆菌ZW3本身具有良好的产胞外多糖特性［23］，其不溶性胞外多糖是生物膜的主要成分，在生物膜形成过程中发挥重要作用，决定生物膜的结构、细菌生长外环境等［24-25］。不同载体表面胞外多糖的分泌量如图4所示，2 d后Alg-Arg和Alg-Lys载体表面胞外多糖分泌量明显高于Alg载体，这为两种载体表面活菌数量的增长奠定了基础；培养3、4 d后各载体表面胞外多糖分泌量趋势与细菌量基本一致，很好地印证了胞外多糖对生物膜形成的作用。4 d后Alg-Arg表面胞外多糖分泌量为Alg-Lys的2.4 倍，这可能一定程度上解释Arg修饰载体在ZW3生物膜形成能力上明显优于Lys修饰载体。

2.5扫描电子显微镜观察

图5　不同载体表面电子显微镜扫描图Fig.5　SEM images of different carriers

Alg-Arg和Alg-Lys载体表面是否形成乳杆菌ZW3生物膜，可通过形貌观察进行判断。由图5可知，Alg载体表面乳杆菌数量稀少，且呈分散分布，未形成明显的生物膜结构，其结果与2.3、2.4节相吻合；而Alg-Arg和Alg-Lys载体表面乳杆菌数量明显增加，菌体紧密聚集，形成团块状结构。由图可知菌体间有错落的生物膜通道（图5B中箭头所示），这是生物膜传送营养和信息的重要结构。菌体间片状物质可能主要为分泌的胞外物质。

3　结 论

综上所述，本实验成功合成氨基酸修饰海藻酸钠载体，并通过核磁、氨基酸含量、ζ电势和水接触角等表征载体性质，在物理性质基本一致的条件下比较Alg-Arg和Alg-Lys对乳酸菌生物膜形成的促进能力。结果发现Alg-Arg和Alg-Lys载体均可以促进马奶酒样乳杆菌ZW3的生长，进而分泌胞外多糖，形成生物膜。其中，Alg-Arg载体效果优于Alg-Lys载体。因此，氨基酸修饰海藻酸钠载体可作为一种食用性乳酸菌生物膜载体，应用于食品领域并可以通过配体种类的选择促进乳酸菌生物膜的形成。

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Preparation and Properties of Edible Amino Acid-Modified Biofilm Carrier

SUN Ye， WANG Yanping， LI Shuya， LIU Zhaoxian， LIU Yuan*
（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

In order to expand the application of lactic acid bacterial biofilm in the food industry and construct edible functional carrier， amino acids which could be used as ligands for bacterial adhesion were modifi ed onto alginate in this study. The structures， compositions， electrical properties and hydrophilicity of the modifi ed carriers （Alg-Arg and Alg-Lys）were characterized by nuclear magnetic resonance， amino acid content analysis， and ζ potential and water contact angle measurement. Lactobacillus kefi ranofaciens ZW3 was cultured on the carriers to investigate its growth and extracellular exopolysaccharide secretion. The results showed that after cultivation for 4 d， the amount of ZW3 on Alg-Arg reached up to 3.8 × 107CFU/cm2， which was 3.5 times as high as that on Alg-Lys. The secretion amount of extracellular exopolysaccharide was 28.2 μg/cm2， which was increased by 2.4 times in comparison with that on Alg-Lys. Compared with lysine-modifi ed carrier， arginine-modifi ed carrier was better for ZW3 growth and the secretion of extracellular exopolysaccharide. These results demonstrated that biofi lm formation could be enhanced by the appropriate ligand.

amino acid； sodium alginate； biofi lm； Lactobacillus； ligand

10.7506/spkx1002-6630-201619010

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0059-05

孙也， 王艳萍， 李淑雅， 等. 氨基酸修饰可食用生物膜载体的制备与性质［J］. 食品科学， 2016， 37（19）： 59-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619010. http：//www.spkx.net.cn

SUN Ye， WANG Yanping， LI Shuya， et al. Preparation and properties of edible amino acid-modified biofilm carrier［J］. Food Science，2016， 37（19）： 59-63. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619010. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-30

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA10090405）；天津科技大学大学生实验室创新基金项目（1414A208）；天津科技大学青年创新基金项目（2014CXLG04）

孙也（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：962275351@qq.com

刘媛（1981—），女，助理研究员，博士，研究方向为食品高分子材料。E-mail：liuyuan0816@tust.edu.cn