槲皮素对H2O2诱导人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用

张佳君，厉新新，陈宝石，刘丽娟



槲皮素对H2O2诱导人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用

张佳君，厉新新，陈宝石，刘丽娟

the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

•METHODS: RPE cells were subculture, and they were divided into negative control group: cultured with normal culture medium; oxidative injury group: 100 μmol/L H2O2treated for 12h; quercetin low dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h; and quercetin high dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection, apoptosis rate was detected by flow cytometry, apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining, expression of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were tested by colorimetric detection.

•RESULTS: Quercetin inhibited H2O2-induced cell viability decreased in RPE cells, after treated with different concentrations of quercetin, RPE cells activity increased to (79.67±4.98)% and (83.00±3.60)%, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (48.93±3.39)% (P<0.05). After treated with different concentrations of quercetin, the apoptosis rate of RPE cells decreased to (23.23±3.29)% and (16.23±1.94)%, respectively, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (38.03±4.76)% (P<0.05). In addition, quercetin also increased the expression of CAT、SOD、GSH-Px in RPE cells, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group.

•CONCLUSION:Quercetin effectively inhibited H2O2-induced RPE cells damage by improving cell antioxidant enzyme activity, which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in RPE cells.

目的:探讨槲皮素对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞(retina pigment epithelium，RPE)氧化应激损伤的保护作用及可能机制。

方法：RPE细胞传代培养，分为阴性对照组：以正常培养液培养；氧化损伤组：100μmol/L的H2O2作用12h；槲皮素低浓度组：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；槲皮素高浓度组：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。MTT比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Hochest33258染色观察凋亡细胞形态，比色法检测细胞中过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

结果：槲皮素能明显抑制H2O2诱导的RPE细胞活力的下降，用不同浓度槲皮素处理后，RPE细胞活性分别提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，与氧化损伤组(48.93%±3.39%)比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；经不同浓度槲皮素处理后，RPE细胞凋亡率分别下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，与氧化损伤组(38.03%±4.76%)比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；此外，槲皮素还能增加细胞中CAT、SOD、GSH-Px活性，与氧化损伤组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

结论：槲皮素通过改善细胞中抗氧化酶活性有效抑制了H2O2对RPE细胞的损伤，从而为其用于治疗RPE细胞损伤提供可靠的实验依据。

槲皮素；视网膜色素上皮；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶

引用：张佳君，厉新新，陈宝石，等.槲皮素对H2O2诱导人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用.国际眼科杂志2016;16(11):2010-2013

0　引言

糖尿病患者因糖代谢障碍导致全身各组织器官的微血管发生病变，其中糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是最严重的并发症之一[1]。研究表明，氧化应激与DR的发生密切相关。视网膜色素上皮层位于视网膜神经上皮层与脉络膜毛细血管层之间，由单层排列的RPE细胞构成，当收到外界各种因素刺激时，容易导致生理功能的破坏，是DR最早受损伤的靶组织[2]。本实验模拟DR发生机制，体外建立RPE细胞氧化损伤模型，对比分析不同浓度的槲皮素干预RPE细胞后细胞活力以及相关因子表达的变化，并进一步探讨其细胞保护机制，为其用于防治DR提供新的实验依据。

1　材料和方法

1.1材料槲皮素(美国Sigma公司，批号 PHR1488，分子量 302.24 )，人RPE细胞株(美国ATCC，批号CRL-4000)，30% H2O2(天津基准化学试剂有限公司，批号20131016)，DMEM培养基(Sigma公司，批号D0819)，胎牛血清(Sigma公司，批号12107C)，MTT试剂盒(Sigma公司，批号M2128)，Annexin V FITC/PI(美国BD公司，批号556570)，Hoechst33258试剂盒(碧云天公司，批号C1011)，CAT、SOD、GSH-Px试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号S0101，S0051，S0053)。

1.2方法

1.2.1细胞培养RPE细胞培养在100μg/mL链霉素及100U/mL青霉素的DMEM培养基中，内含15%胎牛血清，培养箱温度为37℃。

1.2.2细胞分组共分4组：(1)阴性对照组：以正常培养液培养;(2)氧化损伤组：100μmol/L H2O2作用12h；(3)槲皮素低浓度组：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；(4)槲皮素高浓度组：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。

1.2.3 MTT检测细胞活力细胞接种于96孔板(细胞密度5×104/L，每孔120μL培养24h使细胞融合约80%～90%，将原培养液吸出，向各孔细胞中加入20μL终浓度为5g/L的MTT无血清培养液，培养4h后弃去培养液，加入150μL的DMSO溶液，置摇床摇晃10min后用酶标仪测定492nm的光密度值。

1.2.4流式细胞技术检测细胞凋亡各组RPE细胞六孔板内培养，经过相应处理后，用1g/L胰酶消化后制备细胞悬液。1000r/min离心后收集细胞，用Annexin V-FITC试剂盒中缓冲液悬浮细胞，调节细胞浓度为5×104/L，取上述细胞分别按试剂盒说明，加入Annexin和PI，混匀后孵育20min，于1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡，以上操作均在暗室内避光进行。检测结果图共分4个象限，第四象限代表凋亡早期的细胞数量，细胞凋亡率=第四象限凋亡细胞/总细胞数×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态各组RPE细胞六孔板内培养，经过相应处理后，PBS冲洗3次，每次2min，用固定液固定20min后用PBS再冲洗2次，加入染色液暗室内固定20min，吸掉染色液后于倒置显微镜下观察并记录细胞形态(×400)。每组5张不同的图片上各随机选取5个视野计数，凋亡细胞细胞核荧光较强，呈致密浓染，细胞凋亡率=凋亡细胞/总细胞数×100%。

表1槲皮素对RPE细胞活性的影响

，n=3)

注：aP<0.05vs阴性对照组；cP<0.05vs氧化损伤组。

1.2.6 SOD和CAT与GSH-Px活性的检测收集细胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min离心10min，收集细胞并用PBS冲洗2次，每份样品加30μL细胞裂解液，冰上孵育20min，10000r/min离心10min，然后按试剂盒操作步骤测定细胞裂解液中CAT、SOD、GSH-Px活性。

2　结果

2.1槲皮素对H2O2致RPE细胞氧化损伤的影响槲皮素能明显抑制H2O2诱导的RPE细胞活力的下降，氧化损伤组RPE细胞经H2O2处理后，细胞活性明显下降(48.93%±3.39%)，用不同浓度槲皮素处理后，RPE细胞活性分别提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，与氧化损伤组比较，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2槲皮素对氧化损伤致RPE细胞凋亡的抑制作用氧化损伤组RPE细胞凋亡率(38.03%±4.76%)显著高于阴性对照组(2.57%±0.76%)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，H2O2可以导致RPE细胞凋亡的发生，经不同浓度槲皮素处理后，其凋亡率分别下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.3槲皮素对H2O2诱导RPE细胞凋亡的影响Hoechst33258核染色法显示，阴性对照组(3.00%±1.00%)未见明显凋亡染色的细胞核，氧化损伤组(41.67%±4.33%)凋亡细胞明显增多，细胞核荧光较强，呈致密浓染，给予不同浓度的槲皮素作用后凋亡细胞减少(36.67%±4.22%，18.67%±3.45%)，细胞核形态改善，荧光强度逐渐减弱(图2)。与流式细胞计数检测结果一致。

2.4槲皮素对RPE细胞内CAT和SOD与GSH-Px活性的影响从表2中可以观察到，氧化损伤组RPE细胞中CAT、SOD、GSH-Px活性明显降低，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。给予不同浓度槲皮素处理后，CAT、SOD、GSH-Px表达量升高，槲皮素高剂量组与氧化损伤组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3　讨论

高血糖导致的氧化应激增强被认为是糖尿病并发视网膜病变的重要因素，大量证据表明，氧化应激损伤在视网膜疾病的发生发展过程中起着重要的作用[3]。过量的活性氧可直接发挥细胞毒性作用损伤细胞。H2O2常作为建立体外氧化应激损伤模型的工具，分解后产生的羟基自由基可导致细胞氧化损伤，RPE细胞对氧化应激较为敏感，我们利用100μmol/L H2O2建立细胞氧化损伤模型，观察槲皮素对该细胞的保护作用。

图1流式细胞计数检测槲皮素对H2O2诱导RPE细胞凋亡的抑制作用A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：槲皮素低浓度组；D：槲皮素高浓度组；E：槲皮素对H2O2诱导RPE细胞凋亡的抑制作用的柱形图(aP<0.05，bP<0.01vs氧化损伤组)。

图2槲皮素对氧化损伤致RPE细胞凋亡的抑制作用A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：槲皮素低浓度组；D：槲皮素高浓度组； E：槲皮素对H2O2诱导RPE细胞凋亡的抑制作用的柱形图(aP<0.05，bP<0.01vs氧化损伤组)。

表2槲皮素对RPE细胞内CAT和SOD与GSH-PX含量的变化

组别CAT(U/mg)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)对照组46.66±3.0588.74±3.76132.03±3.03氧化损伤组24.57±4.38b51.89±4.66b79.46±3.54b槲皮素低剂量组26.89±3.2959.06±3.4483.03±4.37槲皮素高剂量组39.49±3.83a70.75±3.04a116.57±3.80a

注：aP<0.05vs氧化损伤组；bP<0.01vs对照组。

抗氧化剂因可延缓DR的发展而在DR的防治中得到重视。槲皮素是一种广泛存在于中草药和蔬果中的天然黄酮类化合物，具有多种生物活性，其中包括清除自由基，下调由活性氧介导的下游信号通路[4-5]。国内外还少见槲皮素在眼科中的应用研究，为此该课题利用槲皮素保护RPE细胞缓解由H2O2所致的氧化损伤，初步探讨了槲皮素保护RPE细胞免受氧化损伤的效果与机制。

细胞活力检测结果显示，H2O2处理的细胞活力明显降低，槲皮素能够抑制H2O2诱导的细胞损伤，而且这种药物对细胞的保护作用呈剂量依赖性；流式细胞术及Hoechst33258核染色法测定凋亡结果同样表明，H2O2作用下RPE早期凋亡率明显增加，槲皮素有效抑制了H2O2诱导的凋亡反应的发生。

生理状态下，机体抗自由基损伤的酶如SOD、GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的产生和清除处于平衡；超氧化物歧化酶(SOD)能够提供氢原子配体而使其还原生成H2O2，进而被谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)催化还原生成对人体无害的H2O和O2，进一步降低过氧化损伤[6-7]。用槲皮素干预后RPE细胞中CAT、SOD、GSH-Px活性较氧化损伤组显著升高，提示槲皮素可能通过提高细胞内CAT、SOD、GSH-Px活性发挥其较强的抗氧化作用。

综上所述，槲皮素对H2O2诱导RPE细胞氧化应激损伤具有剂量相关性的保护作用，其作用机制可能与槲皮素能够有效改善抗氧化酶活性、增强自由基清除能力从而抑制氧化应激损伤有关，从而为其用于治疗RPE细胞损伤提供可靠的实验依据。

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2凌静，栾洁.氧化应激与糖尿病视网膜病变.国际眼科杂志 2008；8(11):2312-2315

3陈放，徐珊，吕伟红.糖尿病大鼠视网膜氧化应激损伤及葛根素的干预作用.眼科新进展 2012；32(1):15-19

4刘红亮，胡磊，王靖凯，等.槲皮素对H2O2损伤PC12细胞的保护效果与机制.中国药理学通报 2014；30(3):373-377

5刘鹃，康刚劲.槲皮素对晶状体保护作用的研究进展.国际眼科杂志 2015；15(1):49-51

6 Pehar M, Beeson G, Beeson CC,etal. Mitochondria-targeted catalase reverts the neurotoxicity of hSOD1G93A astrocytes without extending the survival of ALS-linked mutant hSOD1 mice.PLoSOne2014;9(7):e103438

7 Yuhai GU, Zhen Z. Significance of the changes occurring in the levels of interleukins, SOD and MDA in rat pulmonary tissue following exposure to different altitudes and exposure times.ExpTherMed2015;10(3):915-920

Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells

Jia-Jun Zhang, Xin-Xin Li, Bao-Shi Chen, Li-Juan Liu

Li-Juan Liu. the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. 3051136639@qq.com

2016-07-04Accepted：2016-09-28

•AIM: To discuss the protective effects and possible mechanisms of quercetin in oxidative damage of human retina pigment epithelium (RPE) cells induced by H2O2.

quercetin; human retina pigment epithelium; catalase; superoxide dismutase; glutathione

(150001)中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第一医院眼科二病房

张佳君，女，护师，研究方向： 眼底病。

刘丽娟，副主任护师，研究方向：眼底病.3051136639@qq.com

2016-07-04

2016-09-28

Zhang JJ, Li XX, Chen BS,etal. Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(11):2010-2013

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.11.07

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