大孔吸附树脂纯化新疆两色金鸡菊总皂苷

姚新成，张婷，唐辉，陈文

(1.石河子大学 药学院，新疆 石河子　832000；2.石河子大学 新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子　832000)



大孔吸附树脂纯化新疆两色金鸡菊总皂苷

姚新成1,2，张婷1，唐辉1,2，陈文1,2

(1.石河子大学 药学院，新疆 石河子832000；2.石河子大学 新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子832000)

利用大孔吸附树脂纯化新疆两色金鸡菊总皂苷.采用分光光度法测定总皂苷含量，以静态吸附量和解吸率、动态吸附量和解吸率为指标，选择合适的大孔吸附树脂和纯化条件.D-101型大孔吸附树脂对新疆两色金鸡菊总皂苷具有较强的吸附性能和较好的解吸能力.两色金鸡提取液经D-101型大孔吸附树脂处理，可获得质量分数为(40.53±0.81)%(n=3)的总皂苷部位.D-101型大孔吸附树脂可有效地纯化新疆两色金鸡菊总皂苷.

两色金鸡菊；总皂苷；大孔吸附树脂

新疆两色金鸡菊又名“雪菊”、“昆仑雪菊”，为菊科金鸡菊属两色金鸡菊(Coreopsis tinctoriaNutt.)的干燥头状花序.该植物原产于北美洲干旱内陆地区，在中国主要分布在新疆和田地区海拔2 300～3 000m的昆仑山区.当地维吾尔族居民常采集其新鲜头状花序浸泡当花茶饮用，俗称“茶菊”；新疆维吾尔医院也将其作为一种药材使用，具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾等功效[1].

有研究报道，新疆两色金鸡菊中总皂苷的质量分数为8.36%[2].而皂苷类物质也是具有一定生物活性和药效活性的成分[3].在总皂苷的纯化方面，常用有机溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、沉淀分离法、色谱分离法等[4].由于大孔吸附树脂具有物理化学稳定性、吸附容量大、吸附速度快、解吸条件温和等优点，大孔吸附树脂已被广泛用于天然植物提取物的纯化和分离[5-6].目前，国内对新疆两色金鸡菊皂苷的研究报道很少.本研究通过大孔吸附树脂对新疆两色金鸡菊中总皂苷的纯化制备，为综合利用新疆两色金鸡菊植物资源、探索其多样的生物活性和作用机制提供科学依据.

1　仪器与试药

1.1仪器

BP211D电子分析天平(北京Sartorius)；SHA-B水浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂)；恒温水浴锅(金姚市亚星仪器表有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城科工贸易有限公司)；TP300超声波提取器(北京天鹏电子新技术有限公司)；旋转蒸发仪RE-2000(上海亚荣生化仪器厂)；UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；1.0～5.0mL移液器(苏州BIOHIT).

1.2试药

高氯酸(HClO4)；浓盐酸(HCl)；香草醛(天津市光复科技发展有限公司)；石油醚、正丁醇、乙醇、乙酸、甲醇(天津富宇精细化工有限公司),各种试剂均为分析纯；水为蒸馏水.

AB-8、D-101和NKA-9型大孔吸附树脂(天津光复精细化工研究所)；HPD-100、HPD-450、HPD-600和XDA-1型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；DA-201型大孔吸附树脂(安徽三星树脂科技有限公司)；LS-300B型大孔吸附树脂(蓝深树脂科技有限公司).

齐墩果酸(质量分数>98%)购于中国药品生物制品检定所；两色金鸡菊购于新疆和田地区策勒县努尔乡高海拔山区(2013年11月)，经石河子大学药学院李鹏副教授鉴定为菊科金鸡菊属一年生草本植物蛇目菊的干燥头状花序.

2　方法与结果

2.1样品的制备

两色金鸡菊研碎，称取100g粉末，用体积分数55%乙醇(料液比1g∶20mL)超声波(40kHz,250W)提取2次，每次50min.抽滤，合并2次提取液.使用旋转蒸发仪于55 ℃浓缩，至无醇味.再用石油醚(V(石油醚)∶V(提取浓缩液)=1∶1)进行萃取脱脂.去除石油醚层，用水饱和正丁醇溶液进行1∶1萃取，萃取3次，分取正丁醇层.正丁醇萃取液经减压浓缩，挥至尽干.放入冷冻干燥仪中干燥，得总皂苷提取物.

2.2总皂苷的测定

参照励娜等[7]的含量测定方法，以齐墩果酸为对照品，于λ=(545±1)nm处测定样品吸光度A值.根据齐墩果酸标准对照回归方程A= 0.026 7 ρ + 0.060 8 (ρ：μg/mL)，r= 0.996 8.计算样品中总皂苷含量(相当于齐墩果酸含量).

2.3大孔吸附树脂的筛选

2.3.1大孔吸附树脂的静态吸附-解吸实验[8-10]

称取经酸碱预处理好的9种不同极性和孔径的大孔吸附树脂(XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，LS-300-B，HPD-600，DA-201，NKA-9)各2.0g(湿质量)置于100mL具塞锥形瓶中，分别加入25.0mL提取物溶液(总皂苷质量浓度0.3mg/mL).锥形瓶置于恒温水浴振荡器中振摇24h，滤过.按2.2节下的方法测定滤液中总皂苷的质量浓度.将滤出的各型号树脂另置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70%乙醇25.0mL，其余操作同上.滤过，得解吸后的滤液.按含量测定方法测定解吸液的总皂苷质量浓度.按下式计算9种树脂的静态吸附量、解吸量、吸附率及解吸率.

式中 ρ0为加入样液中总皂苷质量浓度(mg/mL)，ρ1为吸附后样液中总皂苷质量浓度(mg/mL)，ρ2为解吸后样液中总皂苷质量浓度(mg/mL)，V1为吸附液体积(mL)，V2为解吸液体积(mL)，m为湿树脂质量(g).

多项研究表明，大孔吸附树脂的极性、孔径、比表面积等性质均对需纯化的物质分离有较大影响，对皂苷的纯化效果影响很大.经试验和计算，9种不同型号的大孔树脂静态吸附-解吸实验结果见表1.

表1　9种大孔树脂的静态吸附和解吸性能Tab.1　Adsorption and desorption capacities of 9 types of macroporous adsorptive resin

由表1测定结果可知，XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，HPD-600型大孔吸附树脂对新疆两色金鸡菊总皂苷的吸附率均超过75%以上；但从解吸性能考察D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450和HPD-600解吸率均超过80%，其他型号树脂解吸率却小于80%.综合考虑，本实验选取XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，HPD-600这6种型号树脂做进一步的动态吸附-解吸能力考察.

2.3.26种大孔吸附树脂的静态吸附-解吸能力考查

称取酸碱预处理好的XDA-1、D-101、HPD-100、AB-8、HPD-450、HPD-600型大孔树脂各2.0g，分别于100mL具塞锥形瓶中.准确加入提取物溶液25.0mL(总皂苷质量浓度0.3mg/mL)，置于恒温振荡器中振摇.分别于0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0h定时取上清液，测定上清液吸光度值并计算吸附率.同时绘制各型号树脂的静态吸附曲线.另将滤出的各型号树脂分别置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70%乙醇25.0mL，其余操作同上.测定解吸液吸光度值并计算解吸率，绘制各型号树脂的静态解吸曲线.各型号树脂的静态吸附曲线和静态解吸曲线结果见图1和图2.

由图1测定结果可知，HPD-100型大孔吸附树脂在3h内对总皂苷的吸附率最快；D-101型树脂次之.2种型号的树脂均在6h后基本达到吸附平衡状态.而其他4种型号的树脂对总皂苷的吸附率上升较平缓，AB-8型树脂随着时间的增加吸附率甚至有下降趋势.由图2测定结果可知，D-101型树脂对总皂苷的解吸率在2h内上升最快，HPD-600次之.2种型号的树脂均在3h后基本达到解吸平衡.

图1　6种大孔吸附树脂的静态吸附曲线Fig.1　Static adsorption curve of six types macroporous adsorptive resin

图2　6种大孔吸附树脂的静态解吸曲线Fig.2　Static desorption curve of six types macroporous adsorptive resin

2.4D-101型大孔吸附树脂纯化新疆两色金鸡菊提取物中的总皂苷

2.4.1上样质量浓度对D-101型树脂吸附率的影响[11-12]

称取5份预处理好的D-101型树脂各2.0g，分别置于100mL具塞锥形瓶中.再分别加入总皂苷质量浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的供试液25.0mL，置于恒温振荡器中振摇吸附7h后，取上清液按2.2项下的测定方法进行测定，计算吸附率.结果见表2.

表2　不同上样质量浓度对树脂吸附率的影响Tab.2　Affection of absorption ratio for total saponins in different mass concentrationof sample on D-101 adsorptive resin

由表2结果可知，当上样液中总皂苷质量浓度为0.9mg/mL时吸附率最高；随质量浓度增大吸附率反而降低，故确定0.9mg/mL为最佳上样液质量浓度.

2.4.2 洗脱溶剂乙醇体积分数对D-101型树脂解吸率的影响

称取6份预处理好的D-101型树脂各2.0g，加入总皂苷质量浓度为0.9mg/mL的样品溶液使之吸附平衡7h后，滤过，洗涤表面.取过滤后的树脂，加入25.0mL体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，置于恒温振荡器上解吸7h后，取上清液按2.2项下的测定方法进行测定，计算解吸率.结果见表3.

表3　不同体积分数的乙醇洗脱剂对树脂解吸率的影响Tab.3　Affection of desorption ratio for total saponins in different volume fractionof ethanol eluent on D-101 adsorptive resin

由表3测定结果可知，当洗脱溶剂乙醇体积分数为80%时，总皂苷的解吸率最大.因此，选择体积分数80%乙醇作为洗脱液.

加速推进潜山市内旅游区域公路与各地高速、铁路、国道的对接，全力打造开放性的旅游交通网络，并加快环天柱山旅游公路和龙潭--万涧旅游公路拓改、积翠谷索道等项目的实施，通过“串点成线”打造全域旅游通道，优化城镇与景区、景区与景区间的交通衔接。

2.4.3D-101型大孔吸附树脂动态吸附实验

称取预处理好的D-101型树脂适量，装入径高比为1∶12的玻璃层析柱.将总皂苷质量浓度为0.9mg/mL的样品液上样，流速控制在20mL/h.按一定的体积收集流出液，并测定每份收集液中总皂苷含量，绘制出树脂动态吸附曲线.结果见图3所示.

图3　D-101型树脂动态吸附曲线Fig.3　Dynamic adsorption curve of D-101 macroporous adsorptive resin

由图3测定结果可知，初始阶段流出液中总皂苷含量很小，树脂的吸附率较高.当上样体积增加到132mL时有明显泄漏，并逐渐接近饱和吸附.故确定132mL为最佳上样量.

2.4.4D-101型大孔吸附树脂动态解吸实验

将上述动态吸附平衡的树脂静置过夜.先用40mL蒸馏水洗去极性较大的水溶性成分，然后用体积分数80%乙醇以40mL/h的流速进行冲洗柱床.适当的体积进行收集，并测定每份收集洗脱液中总皂苷的含量.由此绘制树脂的动态解吸曲线.结果见图4所示.

由图4实验结果可知,20～30mL解吸液中总皂苷的质量浓度达到最大值；当收集洗脱溶剂100mL时解吸液中总皂苷已基本洗脱完全，因此选取100mL为洗脱溶剂用量.

图4　D-101型树脂动态解吸曲线Fig.4　Dynamic desorption curve of D-101 macroporous adsorptive resin

2.5验证实验

按最佳条件进行3次平行实验，即取预处理好的D-101型树脂适量装入层析柱(径高比1∶12)，将132mL样品溶液(总皂苷质量浓度0.9mg/mL)上样(流速20mL/h)，吸附平衡后，静置过夜.先用40mL蒸馏水洗去极性较大的成分，然后用100mL的体积分数80%乙醇进行洗脱(流速40mL/h)，收集20～80mL洗脱液.洗脱液水浴蒸干，计算总固形物重量.经测定固形物中总皂苷质量分数为(40.53±0.81)%(n=3).

3　结果和讨论

本实验通过比较XDA-1、D101、HPD-100、AB-8、HPD-450、LS-300-B、HPD-600、DA-201、NKA-9等9种类型大孔树脂对新疆两色金鸡菊总皂苷静态和动态吸附和解吸性能的考察，最终选取性能较好的D-101型大孔树脂进行实验和工艺过程优化.制备工艺过程经多次验证具有较好的稳定性，并能将提取物中总皂苷质量分数由19.26%大幅提高到40.53%.通过大孔吸附树脂对新疆两色金鸡菊总皂苷的纯化制备，可以为总皂苷的相关药效学活性和化学成分研究提供必要条件.

[1]新疆植物志编辑委员会.新疆植物志:第5卷[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社,1993:93.

[2]张彦丽,韩艳春,阿依吐伦·斯马义.分光光度法测定维吾尔药昆仑雪菊中总皂苷的含量[J].西北药学杂志,2011,26(2):87-88.

ZHANGYanli,HANYanchun,AYITLUNS.ThedeterminationoftotalsaponinsinCoreopsis tinctoriaNutt.fromXinjiangusingspectrophotometry[J].Northwestpharmaceuticaljournal,2011,26(2):87-88.

[3]王楠,宋小骏.皂苷生物活性的研究进展[J].医学研究生学报,2007,20 (2):211-214.

[4]魏永春,张卫,李冲.皂苷的提取与纯化工艺研究进展[J].广东化工,2008,35(11):58-61.

[5]吴修红,马艳春,何录文,等.白芍中芍药内酯苷和芍药苷制备工艺研究[J].中医药学报,2014,42(2)：71-73.

[6]丁轲,崔莹,陆晶晶,等.SP700大孔树脂纯化酸枣仁中三萜总皂苷研究[J].离子交换与吸附,2011,27(1)：33-35.

DINGKe,CUIYing,LUJingjing,etal.Studyonpurificationoftotaltriterpenoidsaponinsinzizyphi spinosi semenbyusingSP700macroporousresin[J].IonExchangeandAdsorption,2011,27(1)：33-35.

[7]励娜,周文杰,禹奇男,等.星点设计—效应面法优化红梅消总皂苷双水相提取工艺[J].天然产物研究与开发,2014,26(5):726-730.

LINa,ZHOUWenjie,YUQinan，etal.Optimizationofaqueoustwo-phaseextractionofsaponinsfromrubusparvifoliusL．bytwodifferentdesigns[J].NaturalProductResearchandDevelopment,2014，26(5):726-730.

[8]鲁桂华,朱瑞罡,王恒,等,大孔吸附树脂纯化新疆大叶补血草根茎中总黄酮工艺考察[J].中国医院药学杂志,2015,35(16):1445-1449.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2015.16.02.

LUGuihua,ZHURuigang,WANGHeng,etal.PurificationoftotalflavonoidsfromLimoniumgmeliniiRhizome in Xinjiang using macroporous adsorptive resin[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy,2015,35(16):1445-1449.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2015.16.02.

[9]崔翰明,张秋燕,林海,等.三七总皂苷的大孔吸附树脂纯化工艺和质量分析研究[J].中草药,2012,43(11):2177-2182.

CUI Hanming,ZHANG Qiuyan,LIN Hai,et al.Purification technology of total saponins in Panax notoginsengwithmacroporousresinandtheirqualityanalysis[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2012,43(11):2177-2182.

[10]张若洁,徐永霞,王鲁峰,等.大孔树脂纯化芦笋总皂苷的工艺研究[J].中草药,2012,43(6):1097-1100．

ZHANGRuojie,XUYongxia,WANGLufeng,etal.PurificationoftotalsaponinsfromAsparagusofficinalisby macroporous resin[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2012,43(6):1097-1100．

[11]任风莲,邱昌桂,连琰.百合总皂甙的提取工艺[J].中南大学学报(自然科学版),2005,36(1):69-72.

REN Fenglian,QIU Changgui,LIAN Yan.Extraction process of total saponins from Li lium Brownii[J].JournalofCentralSouthUniversityofTechnology(NaturalScience),2005,36(1):69-72.

[12]王国军,唐辉,张淑兰,等.大孔树脂纯化核桃隔膜总黄酮的工艺研究[J].中草药,2013,44(19):2688-2692.DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2013.19.011.

WANGGuojun,TANGHui,ZHANGShulan,etal.PurificationoftotalflavonoidsfromdiaphragmaofJuglansregiabymacroporousresin[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2013,44(19):2688-2692.DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2013.19.011.

(责任编辑：梁俊红)

PurificationoftotalsaponinsfromCoreopsistinctoriaNutt.inXinjiangbymacroporousadsorptiveresin

YAOXincheng1,2,ZHANGTing1,TANGHui1,2,CHENWen1,2

(1.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2.MinistryofEducationKeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

ToinvestigatethepurificationprocessoftotalsaponinsfromCoreopsis tinctoriaNutt.usingmacroporousadsorptiveresin.TheassayoftotalsaponinswasdeterminedbyUV-Visspectrophotometry,andtheresinswereselectedusingtheparameters,suchasstaticadsorptioncapacity,desorptionratio,dynamicadsorptioncapacity,andaswellasdynamicdesorptionratio.TheD-101macroporousresinissuitableforpurificationoftotalsaponinsfromCoreopsis tinctoriaNutt.accordingtoitsadsorptionanddesorptionabilityfortotalsaponins.Thetotalsaponinscontentis(40.53±0.81)%(n=3)intotalsolidsthroughD-101macroporousresinpurification.TheD-101macroporousresincanbeusedforpurificationoftotalsaponinsobtainedfromCoreopsis tinctoriaNutt.inXinjiang.

Coreopsis tinctoriaNutt.;totalsaponins;macroporousadsorptiveresin

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.005

2015-08-20

新疆生产兵团重点领域科技攻关项目(2014BA031)；石河子大学高层次人才科研启动项目(RCZX201328)；国家“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09401-007)

姚新成(1973—)，男，江苏睢宁人，石河子大学副教授，博士，主要从事中药与天然产物活性研究.

E-mail:yxc@whu.edu.cn

陈文(1967—)，男，湖南益阳人，石河子大学教授，博士，主要从事药物制剂及新药研究.

E-mail:chen-wen2000@126.com

TQ

A