痰热清注射液对COPD大鼠体内炎症因子及气道黏液高分泌的影响

林观康，黄东晖，蔡凌峰，王慧贤

1.广东省中医院呼吸科，广东 广州 510120；2.广东省中医院珠海医院呼吸科，广东 珠海 519000

◆实验研究◆

痰热清注射液对COPD大鼠体内炎症因子及气道黏液高分泌的影响

林观康1，黄东晖1，蔡凌峰1，王慧贤2

1.广东省中医院呼吸科，广东 广州 510120；2.广东省中医院珠海医院呼吸科，广东 珠海 519000

目的：观察痰热清注射液对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及黏蛋白5AC（MUC5AC）表达的影响，初步探讨痰热清注射液通过炎性介质路径干预COPD大鼠气道黏液高分泌的作用机制。方法：清洁级雄性SD大鼠60只，随机分为空白组、模型组、痰热清组，每组20只，除空白组外，其余2组采用脂多糖（LPS）联合烟熏建立COPD大鼠模型。痰热清组腹腔注射痰热清注射液，空白组和模型组同时给予等量生理盐水腹腔注射。检测大鼠肺功能，肺组织切片行HE染色，测定肺组织匀浆中IL-8、TNF-α及肺泡灌洗液中MUC5AC的含量。结果：与空白组比较，模型组和痰热清组大鼠体量明显下降，模型组气道阻力（RI）和肺总量（TLC）显著升高，第0.1秒用力呼气量与用力肺活量的比值（FEV0.1/ FVC）显著降低，肺泡灌洗液中MUC5AC的含量和肺组织匀浆中的炎症因子IL-8、TNF-α显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；肺动态顺应性（Cdyn） 无显著变化。与模型组比较，痰热清组大鼠体量增加，RI和TLC下降，FEV0.1/FVC升高，MUC5AC和TNF-α含量显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）；IL-8和Cdyn无显著变化。结论：痰热清注射液可以通过抑制炎症介质的释放、调节MUC5AC分泌，来减轻气道炎症，从而改善气道黏液高分泌症状，在一定程度上起到延缓肺功能恶化的作用。

慢性阻塞性肺疾病；痰热清注射液；气道黏液高分泌；肺功能；黏蛋白5AC（MUC5AC）；白细胞介素-8（IL-8）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；动物实验

DOI：10.13457/j.cnki.jncm.2016.10.095

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以持续气流受限为特征的呼吸系统常见病，其发病率高、住院率高、致残率高、医疗费用高，给患者和社会带来沉重负担。慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）是COPD患者就诊以及住院治疗的主要原因，也是庞大医疗费用的主要来源。气道黏液高分泌是AECOPD重要的病理生理特征，在急性发作期气道黏液分泌量增加，且其黏度也明显增加，从而使气道阻塞程度和病情迅速加重。目前认为黏液高分泌已经成为影响COPD病情和预后的关键危险因素，在COPD发病和治疗中具有重要意义，已经成为新的治疗靶点［1］。本课题组总结多年临床经验和前期的临床研究发现，痰热清注射液有改善AECOPD患者支气管通气功能和提高肺功能的作用［2］，但其具体作用机制尚不明确。本研究以气道炎症和黏液高分泌为切入点，观察痰热清注射液对COPD大鼠肺组织、肺泡灌洗液中白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及黏蛋白5AC（MUC5AC）表达的影响，初步探讨其在COPD治疗中的抗炎和改善气道黏液高分泌的作用。

1　材料和方法

1.1动物分组、造模及给药雄性SD大鼠60只，SPF级，体量（200±20g），由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号44002100004220。按随机数字表法将大鼠随机分为3组：空白组、模型组、痰热清组，每组20只，使用品红和苦味酸在大鼠身体的不同部位标记涂点，记录大鼠体量。除空白组外，其余2组气管内滴注LPS加烟雾烟熏复制COPD大鼠模型，在第1、8、15天，用1%的戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将小号灌胃针快速插入气管，用1 mL注射器抽取200 uL LPS溶液（把1 mg LPS溶解于1 mL生理盐水配制成浓度为1 g/L的LPS溶液），缓缓注入气管，然后将固定板直立旋转，使LPS能够均匀分布于两肺。第2～40天（第8、15天除外）将大鼠置入60 cm×50 cm×40 cm熏吸箱内，10支香烟内熏，每天上午、下午各30 min。空白组同期气管内注入生理盐水，其余无特殊处理。造模40天后，痰热清组按成人最大剂量40 mL/60 kg计算，将痰热清注射液用生理盐水按1∶5进行稀释，腹腔注射，每天1次，空白组和模型组同期给予等量生理盐水腹腔注射，连续10天。在实验过程中，模型组大鼠死亡3只，痰热清组死亡2只。

1.2药物与试剂痰热清注射液（10 mL/支），上海凯宝药业股份有限公司，生产批号Z20030054。脂多糖（LPS，货号L2880-10MG）。大鼠IL-8、TNF-α及MUC5AC ELISA试剂盒购自广州妙博生物有限公司。大前门香烟（焦油量23 mg/支，上海卷烟厂）。

1.3主要仪器AllegraX-22R多功能台式冷冻离心机（Beckman Coulter公司）；VICTOR X5酶标仪（Perkin Elmer公司）；Eppendorf系列微量移液器（德国，Eppendorf公司）；光学显微镜、显微摄像仪（日本OLYMPUS公司）；自制动物熏吸箱（60 cm×50 cm×40 cm）。

2　检测指标与统计学方法

2.1一般情况分别观察各组大鼠造模后及治疗后的一般情况，如精神状态、皮毛色泽、活动情况、呼吸、饮水量、体重等情况。

2.2检测大鼠肺功能用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，剥离暴露气管，行气管插管，连接固定后，置于动物肺功能检测仪上，检测肺功能，测定大鼠第0.1秒用力呼气量与用力肺活量的比值（FEV0.1/FVC），气道阻力（RI），肺总量（TLC），肺动态顺应性（Cdyn）。

2.3肺组织病理检查检测肺功能后，迅速开胸分离肺脏，结扎左主支气管，向右肺注入4%多聚甲醛溶液，将右肺连带右主支气管一同拉出，然后剪断右主支气管，将右肺放入4%多聚甲醛瓶中固定，常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色，然后行病理学检查。

2.4ELISA法检测肺泡灌洗液（BALF） 中MUC5AC含量BALF：拔出气管套管，用22G静脉留置针的套针部分经术口插入气管，用手术线结扎固定。用1 mL注射器抽取生理盐水0.8 mL，接于留置针后缓慢注入，同时稍微用力按摩胸部，以便灌洗充分，然后缓慢抽出，灌洗3次，回收约2.4 mL，得到的BALF置于5 mL离心管中，然后在低温离心机4℃3000 r/min条件下离心10 min，离心后吸取上清液2 mL分装到2个1.5 mL的离心管中，分别装得1 mL灌洗上清，-80℃冻存。采用ELISA法按试剂盒说明书进行操作。选取10个合格样本进行检测。

2.5ELISA法检测肺组织IL-8、TNF-α含量肺组织匀浆：取冰冻肺组织匀浆后，在低温离心机4℃，3000 r/min条件下离心10 min，离心后吸取上清液，ELISA法按试剂盒说明书进行操作。选取10个合格样本进行检测。

2.6统计学方法运用SPSS19进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间均数符合正态分布和方差齐性检验的比较运用单因素方差分析，不符合正态分布或不符合方差齐性检验运用非参数检验进行两两比较，取α=0.05为检验标准。

3　结果

3.1一般情况空白组：一般状况好，大鼠毛发有光泽、密度均匀，双目有神，呼吸平稳，饮水量正常，无死亡。模型组：大鼠在烟熏早期出现狂躁不安，第9天起有大鼠出现打喷嚏（类似人擤鼻涕的声音）症状，之后所有大鼠陆续出现打喷嚏、咳嗽及呼吸加深症状，部分大鼠口鼻部有少许黏性分泌物，烟熏后期大鼠神情倦怠，活动减少，毛发易脱毛、黄涩，饮水量增加。痰热清组：大鼠在烟熏过程中表现同模型组，神情倦怠，出现打喷嚏、咳嗽及呼吸加深等症状，后经痰热清注射液腹腔注射，大鼠打喷嚏、咳嗽及呼吸加深等症状逐渐减轻，毛发黄染，精神状态、行为活动较模型组好转，饮水量较正常。

3.2各组大鼠体重变化比较见表1。分别于第1、20、50天测定大鼠体重。与空白组比较，模型组和痰热清组大鼠体量明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，痰热清组大鼠体量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组大鼠体重变化比较（x±s）

3.3各组大鼠肺功能测定结果比较见表2。与空白组比较，模型组RI和TLC显著升高，FEV0.1/FVC显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；Cdyn无显著变化。与模型组比较，痰热清组RI和TLC下降，FEV0.1/FVC升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Cdyn无显著变化。

表2　各组大鼠肺功能测定结果比较（x±s）

3.4各组大鼠肺组织病理形态学观察见图1。各组大鼠肺组织HE染色结果。空白组：支气管黏膜上皮结构完整，管腔内无渗出物，支气管周围较少炎性细胞浸润，未见腺体增生，血管壁未见增厚，肺泡结构正常连续，肺泡壁完整，肺泡腔未见病理性扩大。模型组：支气管黏膜上皮结构排列紊乱，可见部分上皮脱落，管腔内可见炎性渗出，腺体及杯状细胞显著增生肥大，周围可见淋巴增生，支气管壁周围有大量炎性细胞浸润，血管壁增厚，肺泡扩张，肺泡壁变薄或断裂，融合形成肺泡气肿，肺间质血管充血，与人类COPD病理形态学改变相符合，表明COPD大鼠模型复制成功。痰热清组：与模型组比较，炎症有所减轻，炎性浸润减少，腺体及杯状细胞增生减少，血管壁轻度增厚，病理改变有所减轻，从病理角度证实痰热清注射液能有效抑制COPD的气道炎症反应及减轻气道黏液高分泌。

图1　各组大鼠肺组织HE染色结果 （100×）

3.5各组大鼠BALF中MUC5AC含量比较见表3。与空白组比较，模型组BALF中的MUC5AC显著升高；与模型组比较，痰热清组BALF中的MUC5AC显著下降；差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表3　各组大鼠BALF中MUC5AC含量比较（x±s）

3.6各组大鼠肺组织匀浆中IL-8、TNF-α含量比较见表4。与空白组比较，模型组肺组织匀浆中的炎症因子IL-8、TNF-α均显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，痰热清组的TNF-α下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-8无显著变化。

表4　各组大鼠肺组织匀浆中IL-8、TNF-α含量比较（x±s）

4　讨论

COPD是呼吸系统最常见的慢性气道炎症性疾病，以持续气流受限为特征，与气道和肺对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。吸烟和感染是引起COPD发生的重要因素，本研究采用烟熏加气管内滴注LPS的方法建立COPD大鼠模型。从大鼠的一般情况及病理情况看，模型组气道和肺实质的炎症比较严重，且出现肺气肿，肺功能检测显示模型组TLC和气道阻力明显升高，FEV0.1/FVC显著下降，说明烟熏加气管内滴注LPS成功复制COPD大鼠模型。

慢性气道炎症和气道黏液高分泌是COPD的主要病理基础，在急性期气道黏液分泌量增加，且其黏度也增加，加重气道堵塞，从而加重喘息及咳嗽症状，并且细菌容易在局部造成感染，而感染又加重黏液高分泌，从而形成恶性循环。其中MUC5AC是慢性气道炎症性疾病病理性增加的主要黏蛋白（MUC）表型［3］。在对COPD患者气道MUC分子表型的研究中发现，COPD缓解期MUC2 mRNA表达水平明显增加，MUC5AC表达水平因小气道杯状细胞数量的明显增加而有所升高；在COPD急性发作期MUC5AC mRNA表达水平显著增高，而MUC2 mRNA变化不明显，因而认为在COPD急性发作期由杯状细胞分泌为主的MUC5AC过度表达具有特殊的病理意义［4］。

IL-8、TNF-α己经被国内外研究证实是参与COPD气道炎症的重要炎症因子，它们均可刺激气道上皮细胞合成MUC。大量的研究发现IL-8在慢性呼吸道炎症中起着关键性作用，它可以激活中性粒细胞多方面的功能，包括外形的改变、溶酶体酶的释放、超氧化物的产生和增加、黏附分子的表达［5］。TNF-α是慢性气道炎症中的重要前炎性介质，已有研究证明在TNF-α的刺激下，呼吸道上皮表达IL-8，最终反复引起呼吸道慢性炎症和肺组织损伤［6］。TNF-α可引起中性粒细胞在气道聚集，从而参与中性粒细胞诱导黏蛋白合成，以浓度依赖关系刺激MUC5AC分泌。

痰热清注射液是由熊胆粉、山羊角、金银花、黄芩、连翘组成，现代药理研究证实它具有清热、解毒、化痰、镇惊、抑菌、止咳化痰等功效［7］，在抑制炎症、抗病毒、增强免疫等方面具有明显的疗效。彭桂兰采用痰热清治疗慢性支气管炎急性发作患者60例，治疗组在控制咳嗽、咯痰等症状方面较对照组疗效显著，总有效率治疗组（88.3%）明显优于对照组（64.58%），可以迅速缩短病程，提高临床治愈率［8］。龚国良和李欣证明痰热清注射液可有效调节COPD气道炎症过程中的细胞因子IL-10、TNF-α、MPO的释放，临床使用安全，无明显的不良反应［9］。

本研究运用痰热清注射液腹腔注射干预COPD模型大鼠，肺组织病理结果提示大鼠气管、支气管黏膜上皮紊乱，脱落以及杯状细胞增生的情况较模型组有所减少，腺体增生及血管壁增厚情况有所减轻，肺组织匀浆中TNF-α含量、BALF中MUC5AC的含量较模型组大鼠明显下降，提示痰热清注射液可以通过抑制炎症介质的释放，调节黏蛋白分泌，从而减轻气道炎症，改善气道黏液高分泌症状，在一定程度上减轻和改善COPD大鼠肺部的气道重塑，起到延缓肺功能恶化的作用。

［1］Poole P，Chong J，Cates CJ.Mucolytic agents versus placebo for chronic bronchitis or chronic obstructive pulmonary disease［J］.Cochrane Database Syst Rev，2015，29（7）：CD001287.

［2］黄东晖，李硕.痰热清注射液治疗慢性阻塞性肺病急性加重期临床观察［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11（10）：99-100.

［3］Rose MC，Voynow JA.Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease［J］. PhysiolRev，2006，86（1）：245-278.

［4］周向东，童瑾，兰箭.慢性阻塞性肺疾病患者气道粘蛋白分子表型的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25（7）：437-438.

［5］谢静，韩扬，李太生，等.重症急性呼吸综合征患者血浆细胞因子水平的动态改变［J］.中华内科杂志，2003，42（9）：643-645.

［6］郑芳.TNFα结构与功能的关系［J］.国外医学免疫学分册，2003，26（2）：60-62.

［7］祖金池，黄呈森.痰热清注射液的抗炎抗病毒研究［J］.河北医学，2010，16（9）：1112-1114.

［8］彭桂兰.痰热清注射液治疗慢性支气管炎急性发作60例［J］.实用中医内科杂志，2005，19（5）：471-472.

［9］龚国良，李欣.痰热清注射液治疗慢性阻塞性肺病加重期的临床疗效及细胞因子水平的研究［J］.中国中药杂志，2009，34（1）：104-106.

（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

Effect of Tanreqing Injection on Inflammatory Factor and Airway Mucus Hypersecretion in COPD Rats

LIN Guankang，HUANG Donghui，CAI Lingfeng，WANG Huixian

Objective：To observe the effect of Tanreqing injection on expressions of interleukin-8（IL-8），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and mucoprotein 5AC（MUC5AC）of rats with chronic obstructive pulmonary disease（COPD），and to discuss preliminarily mechanism of Tanreqing injection intervening COPD rats airway mucus hypersecretion via inflammatory medium path.Methods：Selected 60 cases of class grade male SD rats，and divided them into the blank group，model group，Tanreqing group randomly，20 cases in each group，and established COPD rats models with lipopolysaccharide（LSP）combined with smudging.Tanreqing group received Tanreqing injection from enterocoelia，at the same time blank group and model group received equivalent normal saline from enterocoelia.Detected lung function of rats，cut lung tissue into slice and HE stained，detected levels of IL-8，TNF-α and MUC5AC in bronchoalveolar lavage fluid of lung tissue homogenate. Results：Comparing with blank group，rats body mass of model group and Tanreqing group were decreased obviously，model group's airway resistance（RI）and total lung capacity（TCL）were increased obviously，ratio of forced expiratory volume at 0.1 second and forced vital capacity（FEV 0.1/FVC）were decreased obviously，levels of MUC5AC in bronchoalveolar lavage fluid and inflammatory factor IL-8 and TNF-α in lung tissue homogenate were increased obviously in model group（P＜0.01）. There was no obvious change on lung dynamic compliance（Cdyn）.Comparing with model group，rats body mass of Tanreqinggroup was increased，RI and TLC decreased，FEV0.1/FVC increased，levels of MUC5AC and TNF-α decreased obviously，differences being significant（P＜0.01）.There were no obvious changes on IL-8 and Cdyn.Conclusions：Tanreqing injection can relieve airway inflammation by restraining release of inflammatory mediator and adjusting MUC5AC secretion，then improve airway mucus hypersecretion symptom and delay lung function deterioration to some extent.

Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）；Tanreqing injection；Airway mucus hypersecretion；Lung function；Mucoprotein 5AC（MUC5AC）；Interleukin-8（IL-8）；Tumor necrosis factor-α（TNF-α）；Animal experiment

R285.5

A

0256-7415（2016）10-0224-04

2016-04-28

广东省科技计划项目（粤科函规财字［2014］807号）

林观康（1988-），女，住院医师，研究方向：呼吸内科。

黄东晖，E-mail：13600001163@139.com。