Fas、cFLIP及TGF-β1在宫颈鳞癌组织中的表达及意义

汤福想，刘玉玲

（郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450014）

Fas、cFLIP及TGF-β1在宫颈鳞癌组织中的表达及意义

汤福想，刘玉玲

（郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450014）

目的研究凋亡相关因子（Fas）、细胞型Fas相关死亡结构域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白（cFLIP）及转化生长因子β1（TGF-β1）在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织和宫颈鳞癌组织中的表达，以及与宫颈鳞癌临床病理和分期的关系，探讨3者在宫颈鳞癌发生、发展中的作用，同时也为寻找宫颈癌的诊断和治疗新靶点提供理论依据。方法采用免疫组织化学法检测59例宫颈鳞癌、45例子宫颈上皮内瘤变（CIN）和15例正常宫颈组织中cFLIP、Fas及TGF-β1的表达，并进行相关临床病理因素分析。结果在宫颈病变由良性到恶性的发展过程中，Fas和TGF-β1的表达水平逐渐降低（P<0.05），cFLIP的表达水平逐渐升高（P<0.05）。在宫颈鳞癌发展过程中，Fas与cFLIP表达呈负相关（P<0.05），Fas与TGF-β1的表达呈正相关（P<0.05）。结论Fas、TGF-β1表达下调，以及cFLIP表达上调在宫颈鳞癌的发生、发展中发挥重要作用。

凋亡相关因子；细胞型Fas相关死亡结构域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白；转化生长因子β1

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例47万例，80%发生在发展中国家，严重威胁女性健康与生命安全。宫颈癌的病因日渐明确，人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续感染是主要原因，但并不是唯一因素。宫颈癌的发展是多因素、多阶段的复杂过程。从宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、原位癌直至最后发展为浸润癌需要5～10年的时间，其过程与癌基因的激活、抑癌基因的突变、抗凋亡基因的过表达有关。Fas是机体凋亡途径的重要启动因子之一，可通过凋亡相关因子（factor associated suicide，Fas）分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，导致细胞程序性死亡。细胞型Fas相关死亡结构域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白[cellular Fas-associateddeathdomain-likeinterleukin-1β-converting enzyme（FLICE）-like inhibitory protein，cFLIP]是新近发现的一种凋亡抑制蛋白，与半胱-天冬氨酸蛋白酶-8（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase-8）结构类似[1]，但与酶不同的是其不具有活性，可与Fas死亡结构域相关蛋白（Fas-associated death domain，FADD）或Caspase-8上的死亡效应结构域（death effect domain，DED）竞争性结合，从而阻断死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC）的形成，使Caspase-8无法激活，Caspase级联反应不能触发，从而强效抑制Fas、肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL）等多种死亡受体诱导的细胞凋亡。近年来发现，与凋亡相关的基因Fas、cFLIP在肿瘤免疫中发挥重要作用，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）也参与肿瘤的发生、发展。本研究应用免疫组织化学法检测石蜡包埋的宫颈鳞癌、CIN和正常宫颈组织中cFLIP、Fas及TGF-β1的表达，探讨3者在宫颈病变及其演变过程中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象

选取2008年1月-2009年12月郑州大学第二附属医院病理科的宫颈组织蜡块119例。其中经手术切除，且病理证实为宫颈鳞癌的组织标本59例，CIN组织45例，正常宫颈组织（子宫肌瘤行子宫全切者的宫颈组织）15例。所有宫颈鳞癌患者术前未经放、化疗，宫颈鳞癌的临床分期采用2000年国际妇产科联盟的标准。其中，Ⅰ期36例，Ⅱ期14例，Ⅲ期9例（Ⅱb期以上宫颈癌患者也可以采取手术治疗，术中盆腔给予放疗药物）。根据病理分级标准，其中高分化28例，中分化15例，低分化16例。根据有无远处转移，其中有淋巴结转移者13例，无淋巴结转移者46例。

1.2实验试剂和方法

鼠抗人Fas单克隆抗体、兔抗人cFLIP多克隆抗体、兔抗人TGF-β1多克隆抗体购自郑州金赛尔生物科技有限公司，3者稀释的浓度分别为1∶150、1∶100和1∶100。采用免疫组织化学法链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP），二氨基联苯胺显色，具体操作按说明书进行，磷酸缓冲溶液代替一抗作空白对照。

1.3结果判断

在宫颈鳞癌细胞的胞质或胞膜中出现棕黄色颗粒为Fas阳性细胞，在宫颈鳞癌细胞胞质中出现棕黄色或黄褐色颗粒为TGF-β1阳性细胞，而在宫颈鳞癌细胞胞质中出现棕黄色或黄褐色颗粒为cFLIP阳性细胞。高倍镜（×400）下结合阳性细胞的计数及细胞的染色强度进行半定量分析[2]。染色强度的评分标准为：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。每张切片任意观察10个视野，按每高倍镜视野阳性细胞数百分比计分，阳性细胞数< 5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%者计2分，51%～75%计3分，≥75%为4分。两种评分相加即为阳性强度，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9～12分为（+++）。（-）为阴性，（+～+++）为阳性。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或百分比表示，用χ2检验，用Pearson相关分析检测Fas、cFLIP与TGF-β1的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Fas、cFLIP及TGF-β1在宫颈不同组织中的表达

Fas阳性表达染色主要定位于细胞质和细胞膜中，cFLIP蛋白呈棕黄色颗粒，定位于细胞质内，而TGF-β1可表达于正常宫颈鳞状上皮细胞、间质成纤维细胞，以及部分淋巴细胞的胞质、癌细胞，间质也可显色，在宫颈癌组织内呈弥漫性表达，在慢性宫颈炎组织中主要在增生旺盛的基底细胞和棘细胞层表达。Fas和TGF-β1阳性表达率在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中依次减弱，差异有统计学意义（P< 0.05）。cFLIP阳性表达率在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中依次增强，3组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1和图1~3。

表1　不同宫颈病变患者Fas、cFLIP及TGF-β1阳性表达率比较例（%）

2.2Fas、cFLIP及TGF-β1表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系

Fas在宫颈鳞癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期的阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。Fas在宫颈鳞癌高、中及低分化组的阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。宫颈鳞癌伴有淋巴结转移的组别中Fas的阳性率为53.8%（7/13），不伴淋巴结转移组中Fas的阳性率为26.1%（12/46），经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。

cFLIP在宫颈鳞癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期的阳性表达率分别为77.8%（28/36）、85.7%（12/14）和88.9%（8/9），经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。cFLIP在宫颈鳞癌高、中及低分化组的阳性表达率分别为75.0%（21/28）、93.3%（14/15）和81.3%（13/16），经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。在宫颈鳞癌伴淋巴结转移组中cFLIP阳性表达率为92.3%（12/13），不伴淋巴结转移组中cFLIP阳性表达率为78.3%（36/46），经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。

TGF-β1在宫颈鳞癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期的阳性表达率分别为55.6%（20/36）、35.7%（5/14）和22.2%（2/9），经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。TGF-β1在宫颈鳞癌高、中及低分化组的阳性表达率分别为67.9%（19/28）、40.0%（6/15）和12.5%（2/16），经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。宫颈鳞癌伴淋巴结转移组中TGF-β1阳性表达率为76.9%（10/13），不伴淋巴结转移组中TGF-β1阳性表达率为37.0%（17/46），经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2　宫颈鳞癌临床病理特征与Fas、cFLIP及TGF-β1阳性表达率的关系

表3　宫颈鳞癌中Fas与TGF-β1表达的关系例

2.3Fas、cFLIP及TGF-β1在宫颈鳞癌组织中表达的相关性

在Fas阳性表达的19例宫颈鳞癌组织中，12例cFLIP阳性表达，在Fas表达阴性的40例宫颈鳞癌组织中，36例cFLIP阳性表达，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步行Pearson相关分析结果表明，Fas与cFLIP表达呈负相关（r=-0.322，P=0.013）。Fas与TGF-β1表达呈正相关（r=0.459，P=0.000）。而cFLIP与TGF-β1的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3、4。

表4　宫颈鳞癌中TGF-β1与cFLIP表达的关系例

图1　Fas在宫颈组织中的表达（SP×400）

图2　cFLIP在宫颈组织中的表达（SP×400）

图3　TGF-β1在宫颈组织中的表达（SP×400）

3 讨论

Fas在多种组织中均有表达，组织细胞类型不同表达程度也不同。Fas是一种由319个氨基酸组成，相对分子质量为45000的Ⅰ型跨膜糖蛋白。Apo-1/ CD95与Fas配体（Fas ligand，Fas-L）组成的Fas系统是体内转导凋亡信号的主要系统之一。Fas与Fas-L结合后，Fas可向细胞内传导凋亡信号，使表达Fas的细胞在数小时内发生凋亡，这是机体清除异物和维持免疫自稳的重要调节手段[3]。近年来许多研究发现，在很多肿瘤中，如食管癌、喉癌、大肠癌等细胞表面均有Fas/Fas-L异常表达，使肿瘤细胞凋亡异常，甚至逃避宿主免疫系统监视。Fas/Fas-L系统就像一把双刃剑，在促进肿瘤增殖及凋亡中发挥着不同的作用[1]。DAS等[4]发现，在恶性肿瘤中Fas表达下调更为常见，提示在肿瘤的发生、发展中，Fas可能比Fas-L发挥更重要的作用。本研究中笔者发现，Fas在正常宫颈组织中的表达远远高于在CIN及宫颈鳞癌中的表达，提示在宫颈癌的发生中可能存在Fas抗原缺失，使细胞毒性T淋巴细胞介导的肿瘤细胞凋亡相对减少，细胞增殖相对增加，Fas表达明显下降或丢失可能是宫颈癌发生并持续发展的重要机制之一。如果能提高肿瘤细胞中Fas的表达及其对凋亡的敏感性，可以为肿瘤提供一个新的治疗途径。另外，笔者还对Fas的表达与宫颈鳞癌临床分期及病理分化程度等的关系进行分析，结果表明，Fas的表达与宫颈鳞癌的病理级别、临床分期有相关性，而与淋巴结有无转移无关。2007年王娟等[5]的研究与本实验结果相似，提示宫颈鳞癌组织中Fas表达的阳性率高低可以初步反映其恶性程度。

1997年IRMLER等[6]在研究恶性黑色素瘤时发现cFLIP为Caspase-8抑制蛋白。其结构类似于Caspase-8，可竞争性结合FADD或Caspase-8上的DED、DISC形成，从而抑制细胞凋亡[7]。已有研究表明，cFLIP在大肠癌[8]、非霍奇金淋巴瘤[9]及颅内外鳞癌等[10]肿瘤组织中过度表达，而对应的正常组织或良性病变中cFLIP不表达或低表达。本研究结果表明，cFLIP表达水平在宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织中依次减弱，差异有统计学意义，提示cFLIP是促进肿瘤发生、发展的重要调控因子之一。因此推测，细胞染色体异常改变等多种因素，可激活cFLIP基因，导致其过度转录表达，使cFLIP蛋白水平增高，抑制异常细胞的凋亡，从而促进细胞恶化。本实验中笔者研究cFLIP与肿瘤临床病理学特征之间的关系后发现，cFLIP的阳性率与宫颈鳞癌的临床分期、病理分级及淋巴结转移无相关性。

TGF-β1是一种具有多功能的多肽类细胞生长因子，主要作用为促进细胞分化和转化、促进血管生成、刺激细胞外基质增殖等。近年来研究发现，TGF-β1在肿瘤的发生、发展过程中表现为两种不同甚至截然相反的作用：①在肿瘤的早期阶段主要发挥抑制作用；②在肿瘤进展的过程中则抑制增殖作用丧失或减弱，起促进肿瘤生长和转移的作用。本研究发现，TGF-β1在CIN及宫颈鳞癌组织中的表达低于正常宫颈组织，说明TGF-β1下降或缺失在宫颈癌发展中发挥重要作用。在多种肿瘤组织中发现有TGF-β1表达，并且与肿瘤的侵袭、转移相关[11-12]，本研究中笔者也对TGF-β1与临床病理特征的关系进行进一步研究，结果表明，TGF-β1的表达与宫颈鳞癌临床分期无关，而与病理分级、淋巴结转移相关。TGF-β1可作为判断肿瘤恶性程度的指标。目前，认为在癌细胞的侵袭和转移方面，TGF-β1的作用机制主要有以下4个方面[13]：增加肿瘤细胞与胞外基质如胶原蛋白、纤黏连蛋白的相互作用，抑制免疫活性细胞的增殖，抑制淋巴细胞的分化，促进新生血管的形成。

本研究结果表明，Fas表达下调可以引起细胞凋亡抑制，在宫颈鳞癌的发生、发展中起一定作用。在宫颈鳞癌组织中，Fas蛋白表达下调，两者表达呈负相关，促进凋亡基因Fas与抗细胞凋亡基因cFLIP在调节宫颈鳞癌细胞的凋亡过程中，途径相同，作用却是完全相反的。有报道表明，小鼠cFLIP转基因肿瘤细胞在体内能逃避Fas介导的T淋巴细胞的免疫监视，且肿瘤细胞中cFLIP表达水平同其抵抗Fas诱导的细胞凋亡活性有相关性，提示cFLIP可能通过阻断Fas介导的凋亡信号传导途径，导致肿瘤细胞逃避机体的免疫细胞监视[14]。说明在宫颈鳞癌的发展、过程中，Fas与cFLIP共同发挥作用，并且cFLIP的抗细胞凋亡作用增强，抑制Fas的促进细胞凋亡作用。本研究还显示，TGF-β1和Fas的表达呈正相关。Fas启动是机体凋亡途径的重要因子之一，与受体结合后，能激活Caspase并将刺激信号传递到细胞膜内，活化核酸内切酶，引起DNA降解，导致细胞程序性死亡。有文献报道，TGF-β1在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中，有p53、Bax、Bcl-2、Caspase、细胞色素C等相关基因的参与[15-16]，说明两者在宫颈癌的发生、发展中通过Caspase基因联系在一起。总之本研究和上述学者的研究进一步证实，Fas、cFLIP和TGF-β1在肿瘤发展中通过某些因子存在内部联系。

宫颈癌的发生是多种基因共同作用的结果，通过对该基因进行研究可以在分子水平上认识宫颈癌的发生机制，并由此设计新的治疗方案和筛选新的治疗药物。但该基因在宫颈癌发生、发展中的具体机制还需更深入的研究，需要对其在宫颈癌早期诊断、治疗和预后中的潜在应用价值做进一步探索。

[1]MARTIN-VILLALBA A,LLORENS-BOBADILLA E,WOLLNY D.CD95 in cancer:tool or target[J].Trends Mol Med,2013,19(6): 329-335.

[2]邢传平,刘斌,董亮,免疫组织化学标记结果的判断方法[J].中华病理学杂志,2001,30(4):318.

[3]IWASE M,KONDO G,WANTANABE H,et al.Regulation of fas-mediate apoptosis in neutrophils after surgery induced acute inflammation[J].J Surg Res,2006,134(1):114-123.

[4]DAS H,KOIZUMI T,SUGIMOTO T,et al.Quantitation of Fas and Fas ligand gene expression in human ovarian,cervical and endometrial carcinomas using real-time quantitative RT-PCR[J]. Br J Cancer,2000,82(10):1682-1688.

[5]王娟,王薇,罗爱月.Fas、FasL及cFLIP在宫颈病变中的表达与宫颈癌发生、发展相关性的初步探讨[J].中国癌症杂志,2007,17(9): 674-678.

[6]IRMLER M,THOME M,HAHNE M,et al.Inhibition of death receptor signals by celluar FLIP[J].Nature,1997,388(6638): 190-195.

[7]VALENTE G,MANEROI F,PERACCHIO C,et al.cFLIP expression correlates with tumour progression and patient outcome in non-Hodgkin lymphomas of low grade of malignancy[J].Br J Haematol,2006,132(5):560-570.

[8]RYU B K,LEE M G,CHI S G,et al.Increased expression of cFLIP(L)in colonic adenocarcinoma[J].J Pathol,2001,194(1):15-19.

[9]THOMAS R K,KALLENBORN A,WICKENHAUSER C,et al. Constitutive expressionof cFLIP in hodgkin and reed-sternberg cells[J].Am J Pathol,2002,160(4):1521-1528.

[10]张颖奇,李华,徐波,等.cFLIP、TBX2在颅内外鳞癌中的表达及意义[J].中国实用神经疾病杂志,2014,17(10):100-101.

[11]HAZELBAG S,KENTER G G,GORTER A,et al.Prognostic relevance of TGF-beta1 and PAI-1 in cervical cancer[J].Int J Cancer,2004,112(6):1020-1028.

[12]XIONG B,GONG L L,ZHANG F,et al.TGF beta1 expression and angiogenesis in colorectal cancer tissue[J].World J Gastroenterol,2002,8(3):496-498.

[13]王春雷,黄志强,万远廉,等.TGF-β诱导人肝癌细胞系凋亡信号转导机理的研究[J].中国普外基础与临床杂志,2005,12(5): 480-482.

[14]PETER M E,KRAMMER P H.The CD95(APO-1/Fas)DISC and beyond[J].Cell Death Differ,2003,10(1):26-35.

[15]BADAWI A F,EL-SOHEMY A,STEPHEN L L,et al.The effect of dietary polyunsaturated fatty acids on the expression of cyclooxygenase 1 and 2 and levels of p21 ras in rat mammary glands[J].Carcinogenesis,1998,19(5):905-910.

[16]程时丹,王晓瑾,乔敏敏,等.Smad4基因抑制人类胃癌细胞株生长的作用机制[J].上海交通大学学报（医学版）,2007,27(5):546-551.

（童颖丹编辑）

Expressions of Fas，cFLIP and TGF-β1in cervical squamous cancer and their implication

Fu-xiang Tang，Yu-ling Liu
（The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China）

Objective To study the expressions of factor associated suicide（Fas），cellular Fas-associated death domain-like interleukin-lβ-converting enzyme（FLICE）-like inhibitory protein（cFLIP）and transforming growth factor-β（TGF-β1）in the tissues of normal cervix，cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and cervical squamous carcinoma as well as their relationships with the clinical pathology and staging of cervical squamous carcinoma，and explore their roles in the occurrence and development of cervical squamous carcinoma，so as to provide certain theoretical evidence for seeking a new target of diagnosis and treatment of cervical squamous cancer.Methods Immunohistochemical staining was used to examine the expressions of Fas，cFLIP and TGF-β1 in different cervical tissues.Their relationships with clinicopathological factors were analyzed.Results From the normal cervical tissues，CIN to cervical squamous carcinoma，the expression levels of Fas and TGF-β1 gradually decreased（P＜0.05），and cFLIP expression gradually increased（P＜0.05）.There was a closely negative correlation between Fas and cFLIP expressions（P＜0.05），and a positive correlation between Fas and TGF-β1 expressions（P＜0.05）in the development of cervical squamous carcinoma.Conclusions Down-regulation of Fas and TGF-β1 expressions and up-regulation of cFLIP expression play important roles in the development of cervical squamous carcinoma.

Fas；cFLIP；transforming growth factor beta 1

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.011

1005-8982（2016）19-0052-06

2015-05-03

刘玉玲，E-mail：zzly163@163.com