转基因增强绿色荧光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的变化*

贺可贵，闵祥栋，王云，韩纪举，辛晓明，赵晓民

（1.泰山医学院药理学教研室，山东 泰安 271016；2.泰山医学院动脉粥样硬化研究所，山东 泰安 271000）

转基因增强绿色荧光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的变化*

贺可贵1，闵祥栋1，王云2，韩纪举2，辛晓明1，赵晓民1

（1.泰山医学院药理学教研室，山东 泰安 271016；2.泰山医学院动脉粥样硬化研究所，山东 泰安 271000）

目的探讨转基因增强绿色荧光蛋白小鼠血小板黏附和聚集功能的变化。方法选用12～14周龄转基因增强绿色荧光蛋白小鼠和C57BL/6J小鼠，戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，肝素抗凝，全自动血细胞分析仪测定血小板参数，灌流小室法测定血小板在胶原面的黏附变化，比浊法测定不同浓度二磷酸腺苷诱导下的血小板最大聚集率。结果与转基因增强绿色荧光蛋白雄性小鼠比较，雌性小鼠的血小板数、血小板平均体积、血小板压积、黏附率和最大聚集率（二磷酸腺苷3、10和30μmol）下降（P<0.05）；与C57BL/6J雌性小鼠比较，转基因增强绿色荧光蛋白小鼠血小板数降低（P<0.05）。结论转基因增强绿色荧光蛋白雌雄小鼠之间血小板数、血小板平均体积、血小板压积和黏附聚集功能有差异，转基因增强绿色荧光蛋白小鼠与C57BL/6J雌性小鼠之间血小板数也有差异。

血小板；转基因；增强绿色荧光蛋白；黏附；聚集

转基因增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠是在C57BL/6J小鼠的基因组中导入ACTB-EGFP基因，在小鼠体内表达产生荧光蛋白。在紫色光照射下，该蛋白产生绿色荧光，也使得小鼠整个身体呈现绿色荧光。除毛发和红细胞外，ACTB-EGFP基因在其他细胞中均能表达,因此，在荧光显微镜下其他组织均可产生荧光[1-2]。目前,绿色荧光蛋白转基因小鼠是一种重要的工具小鼠，现已在发育、免疫、细胞生物学等研究中不可或缺[3]，为胚胎干细胞、人类基因功能、人体组织工程和克隆器官等提供基础研究。

血小板黏附聚集功能在出血和缺血性疾病中起重要作用，利用转基因EGFP小鼠进行黏附功能的测定及荧光成像具有操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，可广泛应用于活体动物体内成像[4-6]。由于血小板在荧光显微镜下显示荧光，因此不需染色，黏附实验图像采集可直接在荧光显微镜下进行，计算黏附面积或者荧光强度即可，简单方便。关于转基因EGFP小鼠黏附聚集功能的研究较少，目前YANG等人[7]将EGFP作为Gz敲除的报告基因，观察血小板Gz对聚集的影响。付斌等人[8]对血小板特异性整合蛋白仪αⅡbβ3有所研究。本实验对转基因EGFP小鼠血小板黏附聚集功能进行测定，并与C57BL/6J小鼠进行比较，为该小鼠血小板方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物

选用12～14周龄转基因EGFP小鼠和C57BL/ 6J小鼠各15只，体重20～25g。转基因C57BL/16-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠由复旦大学实验动物中心惠赠，C57BL/6J小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）20120001]，饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供，饲养环境温度18～26℃，相对湿度50%～70%，光照明暗交替12 h/d，动物自由进食饮水。

1.2仪器

CHRONO-LOG血小板聚集分析仪（美国Chrono-Log公司，MODEL 700型），台式离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司，TG16-WS型），全自动血细胞分析仪（深圳市康普电子有限公司，PE-6800VET型），灌流小室由荷兰乌特勒兹大学血栓与止血实验室提供，循环水式多用真空泵（郑州城科工贸有限公司，SHB-Ⅲ型），数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂，BT-100B型），显微镜（日本Olympus公司，BX51型），Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM图像采集分析处理系统，电子天平（上海精密科学仪器有限公司，JA31001型）。

1.3药物与试剂

戊巴比妥钠（Merck，北京金鑫天佑分装），0.9%生理盐水（山东鲁抗辰欣药业有限公司），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（美国Sigma公司），牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（美国Sigma公司），肝素钠注射液（上海第一生化药业有限公司）。胶原的制备：断头处死老年大鼠（>50周龄），取鼠尾洗净后置于75%酒精中浸泡5min，取出尾腱后在生理盐水中浸泡1h，吸干水分称重、剪碎，放入0.1 mol醋酸溶液中（4%）搅拌溶解。4℃放置24 h后4 000 r/min离心15min取上清即成。

1.4血小板参数测定

动物以戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，心脏取血肝素抗凝[9]，全自动血细胞分析仪检测血小板数、血小板平均体积、血小板压积和血小板平均宽度。再将血液分成两部分，分别检测血小板黏附率和聚集率。

1.5血小板黏附率测定

用氮气喷枪将0.1 mol醋酸溶解的胶原蛋白均匀喷到盖玻片（1.2 mm×1.2 mm）上，每片胶原蛋白含量20μg。在1%BSA中封闭15min后，包被胶原蛋白的盖玻片放置在灌流小室上，调整血液流速，流经灌流小室产生300/s切变率，每只动物的肝素抗凝血灌流时间分别为4和5min，重复3次。血液灌流结束，HEPES溶液冲洗盖玻片，分别经戊二醛、甲醇固定，May-Grünwald-Giemsa液染色，在400倍镜下每片随机选取10个视野，Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM图像采集分析处理系统计算各视野血小板黏附率（血小板面积/整个视野面积），10个视野血小板黏附率的均值为单次血小板黏附率，3次血小板黏附率的均值为一只动物的血小板黏附率[10]。

1.6血小板聚集率检测

将肝素抗凝血离心（1 100 r/min）10 min，吸出上层富血小板血浆后，再以3 800 r/min离心10 min制备贫血小板血浆。先用贫血小板血浆调整富血小板血浆血小板数为300×109/L，再用生理盐水将血小板数调整至200×109/L，贫血小板血浆按照同比例加生理盐水稀释作为聚集参照，应用CHRONO-LOG血小板聚集分析仪，分别加入终浓度为3、10和30μmol ADP，测定血小板最大聚集率来反映血小板聚集率的变化。

1.7统计学方法

采用Graphpad Instat V3.0统计软件进行数据处理，计量数据用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板参数变化

转基因EGFP雄性小鼠与转基因EGFP雌性小鼠血小板数、血小板平均体积、血小板压积比较，经t检验，差异有统计学意义，转基因EGFP雄性小鼠血小板数、血小板平均体积、血小板压积高于转基因EGFP雌性小鼠；转基因EGFP雌性小鼠与C57BL/6J雌性小鼠血小板数比较，经t检验，差异有统计学意义（t=4.517，P=0.002），转基因EGFP雌性小鼠血小板数低于C57BL/6J雌性小鼠；但转基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之间和C57BL/6J雄性小鼠与雌性小鼠之间上述血小板参数差异无统计学意义。见表1。

表1　转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板参数比较（±s）

表1　转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板参数比较（±s）

注：1）与转基因EGFP雌性小鼠比较，P<0.05；2）与C57BL/6J雌性小鼠比较，P<0.05

组别血小板数（×109/L）血小板压积/%转基因EGFP小鼠雄性659.3±47.31）9.7±0.41）8.3±0.20.60±0.01）雌性503.1±34.52）8.2±0.98.1±0.50.45±0.1 t值5.9663.4060.8303.355 P值0.0000.0090.4300.010 C57BL/6J小鼠雄性628.9±66.89.9±1.08.5±0.60.6±0.1雌性588.7±24.68.9±0.48.3±0.30.5±0.1 t值1.2622.0760.6671.581 P值0.2420.0720.5240.153血小板平均体积/fl血小板分布宽度/%

2.2转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板黏附率

表2　转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比较（%±s）

表2　转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比较（%±s）

注：†与转基因EGFP雌性小鼠比较，P<0.05

血小板黏附率灌流4min灌流5min转基因EGFP小鼠雄性52.4±7.8†56.5±8.9雌性42.9±4.451.9±7.2 t值2.3720.899 P值0.0450.355 C57BL/6J小鼠雄性48.4±7.257.0±5.1雌性44.0±4.756.6±4.8 t值1.1440.128 P值0.2860.902组别

转基因EGFP雄性小鼠与转基因EGFP雌性小鼠血小板黏附率比较，经t检验，灌流时间为4 min时差异有统计学意义，转基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于转基因EGFP雌性小鼠；但转基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之间和C57BL/6J雄性小鼠与雌性小鼠之间血小板黏附率差异无统计学意义。见表2。

2.3转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率

转基因EGFP雄性小鼠与转基因EGFP雌性小鼠不同ADP浓度下的血小板最大聚集率比较，经t检验，差异有统计学意义，转基因EGFP雄性小鼠不同ADP浓度下的血小板最大聚集率高于转基因EGFP雌性小鼠；C57BL/6J雄性小鼠与C57BL/6J雌性小鼠不同ADP浓度下的血小板最大聚集率比较，经t检验，差异有统计学意义，C57BL/6J雄性小鼠不同ADP浓度下的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之间不同ADP浓度下的血小板最大聚集率差异无统计学意义。见表3。

表3　转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比较（%±s）

表3　转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比较（%±s）

注：1）与转基因EGFP雌性小鼠比较，P<0.05；2）与C57BL/6J雌性小鼠比较，P<0.05

组别血小板最大聚集率ADP 3μmolADP 10μmolADP 30μmol转基因EGFP小鼠雄性53.9±4.11）62.3±1.21）69.3±8.11）雌性33.0±1.455.0±1.756.0±1.7 t值10.7877.8443.593 P值0.0000.0000.007 C57BL/6J雄性49.8±7.52）66±3.72）69.8±5.72）雌性34.8±1.753.5±0.660.2±3.9 t值4.3617.4573.108 P值0.0000.0000.015

3 讨论

血小板活化在出血、止血和血栓形成过程中非常重要，与多种疾病有关，如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、脑血管疾病等，也是炎症易化及进展的关键环节之一。血小板活化重要的表现为黏附和聚集功能的增强[11]。了解实验动物血小板的活化有助于利用该种动物开展相关疾病的研究[12]。

研究血小板参数是评价血小板功能的基本指标。转基因EGFP雄性小鼠血小板数、血小板平均体积、血小板压积高于转基因EGFP雌性小鼠，提示转基因EGFP雌雄小鼠之间血小板功能可能有差别，这种差异也存在于C57BL/6J雌雄小鼠之间。另外,. 6J雌性小鼠。

为进一步明确转基因EGFP小鼠血小板功能，笔者观察了血小板黏附、聚集变化。与上述血小板参数变化相似，灌流时间为4 min时转基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于转基因EGFP雌性小鼠，进一步证明转基因EGFP小鼠血小板功能的性别差异。但转基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之间和C57BL/6J雄性小鼠与雌性小鼠之间血小板黏附率差异无统计学意义。不同ADP浓度下，转基因EGFP雄性小鼠的血小板最大聚集率高于转基因EGFP雌性小鼠；同样，不同ADP浓度下，C57BL/6J雄性小鼠的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但不同ADP浓度下，转基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之间的血小板最大聚集率差异无统计学意义。

EGFP被广泛用于报告基因来检测目标基因在特定组织和器官的表达。迄今为止，体外研究发现EGFP对细胞基本无毒害，大部分在体研究结果与体外研究结果一致。SHEEN等[13]证实，在玉米转基因植株中，即使EGFP在细胞中有很高的表达量，对细胞也不会产生明显毒害。根据本实验数据可知，转基因EGFP雌雄小鼠之间血小板功能有差异，但除了转基因EGFP雌性小鼠血小板数低于C57BL/6J雌性小鼠外，转基因EGFP小鼠血小板和C57BL/6J小鼠血小板之间是无差异，提示转EGFP基因可能会对小鼠血小板有影响，但仍需进一步确定。

转基因EGFP小鼠是在C57BL/6J小鼠的基础上构建成功，但在血小板参数等指标上确实存在差异，这与田小芸等[1]所得出的结论一致。病理检测发现转基因EGFP小鼠部分胸腺发育缺陷，推测绿色荧光蛋白可能影响动物的发育[14]，提示这也可能是EGFP基因影响雌性小鼠血小板功能的原因。

每个品种品系的动物都有其自身的生物学特征，这也是区别其他动物的基础[2]，由于性别不同某些生理特性有所不同[1]。本实验所测血小板参数指标中，雄性小鼠的血小板数、血小板平均体积、血小板压积高于雌性小鼠；血小板功能指标中，雄性小鼠的血小板黏附面积和最大聚集率均高于雌性小鼠，虽然雌雄之间有差异，但在正常波动范围内[15-19]。

本实验通过对转基因EGFP小鼠与C57BL/6J小鼠血小板参数、黏附和聚集功能变化的测定，观察两种小鼠及其性别之间的差异，为转基因C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠资料库的建立提供参考。但转基因EGFP雌性小鼠血小板功能改变的内在机制还需进一步研究。

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（申海菊编辑）

Changes of platelet adhesion and aggregation function in transgenic EGFP mice*

Ke-gui He1，Xiang-dong Min1，Yun Wang2，Ji-ju Han2，Xiao-ming Xin1，Xiao-min Zhao1
（1.School of Pharmacology Sciences，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016，China；2.Institute of Atherosclerosis，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271000，China）

Objective To measure the changes of platelets adhesion and aggregation function in transgenic enhanced green fluorescent protein（EGFP）mice.Methods Transgenic EGFP and C57BL/6J mice（12-16 weeks，both male and female）were used for the present study.The mice were anesthetized with Pentobarbital sodium and blood was taken from the heart anticoagulated with Heparin.Platelet parameters were measured using an automated blood cell analyzer.Platelet adhesion on collagen surface was evaluated using a welldefined perfusion chamber.The maximum aggregation rate of platelets induced by ADP was determined by turbidimetry.Results In transgenic EGFP mice，platelet count，mean platelet volume（MPV），plateletcrit（PCT），adhesion rate and the maximum aggregation rate（ADP final concentration was 3 μmol，10 μmol and 30 μmol respectively）of the female mice were decreased compared with those of the male ones（P＜0.05）.In the female mice，platelet count of the transgenic EGFP mice were decreased compared with that of the C57BL/6J mice（P＜0.05）.Conclusions There are differences in platelet count，MPV，PCT，adhesion rate and the maximum aggregation rate between male and female transgenic EGFP mice.There is also difference in platelet countbetween female transgenic EGFP mice and C57BL/6J mice.

platelet；transgene；enhanced green fluorescent protein；adhesion；aggregation

R 331.143

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.002

1005-8982（2016）19-0006-05

2016-03-23

国家自然科学基金（No：81173061）；泰山地产中药研发协同创新中心基金，山东省自然科学基金（No：ZR2014HQ007），泰安市科技发展计划项目（No：201440774-25）

贺可贵，现在宁阳县人民医院临床药学部。E-mail：hekegui0724@yeah.net

赵晓民，E-mail：zhaoxiaominty@163.com