脂联素在结直肠癌患者中的表达及其对结直肠癌细胞增殖和Caspase-3表达的影响

解寒冰，夏云展，薛建锋，杨大勇

（1.河南省郑州人民医院普通外科，河南 郑州 450053；2.郑州大学第一附属医院肝胆外科，河南 郑州 450052）

脂联素在结直肠癌患者中的表达及其对结直肠癌细胞增殖和Caspase-3表达的影响

解寒冰1，夏云展1，薛建锋2，杨大勇1

（1.河南省郑州人民医院普通外科，河南 郑州 450053；2.郑州大学第一附属医院肝胆外科，河南 郑州 450052）

目的测定结直肠癌(CR C）患者血清中脂联素水平，观察脂联素对人结直肠癌细胞LoVo增殖及凋亡相关蛋白Caspase-3的影响，初步探讨其在CR C中的作用机制。方法酶联免疫吸附试验检测CR C组及健康对照组血清脂联素水平，活细胞计数法试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）细胞增殖试验检测重组人脂联素对LoVo细胞增殖的影响，Western blot检测重组人脂联素作用细胞后Caspase-3蛋白的表达。结果CR C组血清脂联素水平（3.5±2.5）μg/ml低于健康对照组（4.6±2.1）μg/ml，差异有统计学意义（P<0.05）。与健康对照组比较，重组人脂联素作用LoVo细胞后，对细胞增殖有抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05），活化的Caspase-3蛋白表达量增加，且有剂量-效应和时间-效应。结论血清脂联素水平与CR C发病风险密切相关，重组人脂联素可以抑制LoVo细胞生长，呈时间-剂量依赖性，其机制可能与Caspase-3活化相关。

结直肠癌；脂联素；细胞增殖；Caspase-3

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤，占全部癌死亡原因的第3位[1]。多种风险因素可以促进CRC的发展，包括饮食和遗传。多项研究表明，肥胖与CRC发病风险增加有关[2]，其中肥胖引起脂肪组织增加，导致脂肪细胞因子（脂联素、瘦素和肿瘤坏死因子-α）分泌的改变，可能影响癌症启动和转移[3-4]。有研究表明，脂联素降低可能与结直肠癌的发生密切相关[5]。本研究拟检测CRC患者外周血中脂联素的表达水平，探讨脂联素与CRC患者发病的相关性，并用重组人脂联素作用于结肠癌细胞，观察其对细胞增殖及凋亡的作用，为脂联素在CRC中作用机制的研究提供更多理论支持。

1 材料与方法

1.1一般资料

1.1.1研究对象选取2015年1月-2016年1月郑州人民医院收治的原发性结直肠癌患者共58例（CRC组）。其中，男性34例，女性24例；平均年龄（55.4±8.5）岁，体重指数（body mass index，BMI）（23.4± 3.3）kg/m2，均经病理诊断为腺癌。其中直肠癌19例，结肠癌39例；高分化癌5例，中分化癌25例，低分化癌28例。根据国际抗癌联盟指定的TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期27例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例。所有入选患者入组前未接受任何治疗。术前血清标本采集后，置入-80℃冰箱保存备用。收集同期健康体检者30例为健康对照组。其中，男性18例，女性12例；平均年龄（52.6±9.3）岁，BMI（23.2±2.4）kg/m2，经腹部超声检查、X线检查、血常规检查和生物化学检查，确定无恶性肿瘤。两组在性别、年龄上比较，差异无统计学意义。所有入选对象签署知情同意书。

1.1.2细胞株及主要试剂LoVo人结直肠癌细胞株（上海中国科学院细胞库），重组人脂联素（美国Prospec公司），脂联素酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（美国RD公司），活细胞计数法试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）细胞增殖检测试剂盒（江苏凯基生物技术公司），兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（以下简称Caspase-3）一抗（#9665，美国CST公司），兔抗人β-肌动蛋白一抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术公司），增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）发光液（美国Millipore公司）。

1.1.3主要实验仪器奥地利CliniBio-128酶标仪（奥地利CliniBio公司），美国Bio-Rad电泳仪（美国Bio-Rad公司），美国UVP GelDoc-It310凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.2实验方法

1.2.1标本采集待测者清晨空腹采取静脉血2ml，室温静置2h，3000×g离心5min，取血清置于-80℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.2外周血中脂联素水平检测采用ELISA检测CRC组及健康对照组血清中脂联素的水平，按照美国RD公司ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定结果。

1.2.3细胞增殖实验人LoVo细胞培养于Ham's F-12K培养基中（含10%胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100 u/ml），在37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。取对数生长期的LoVo细胞以100μl/孔（约含1×104个细胞）接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同终浓度的重组人脂联素（终浓度分别为0、15、30、60和90ng/ml），每组设6个平行孔，于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24和48h后，各孔加入10μl CCK-8溶液，继续孵育4 h后，酶标仪在450 nm波长测定各孔吸光度（optical delnsity，OD）值。细胞抑制%=（对照细胞OD值-加药细胞OD值）/对照细胞OD值×100%。

1.2.4Western blot检测Caspase-3表达水平不同浓度重组人脂联素分别培养细胞24 h，同时以60ng/ml重组人脂联素分别培养细胞12、24和48h，胰酶消化收集各组的细胞，蛋白裂解液处理并制备蛋白样品。根据蛋白定量结果调整每孔上样量，将蛋白样品加在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中进行电泳，电泳结束后用湿转法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭2 h，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗膜后分别加入Caspase-3（1∶1 000稀释）、β-肌动蛋白（1∶300稀释）一抗，4℃冰箱孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗（1∶5000稀释）室温孵育1 h，加发光液进行化学发光显影，美国UVP Gel Doc-It 310凝胶成像系统拍照。

1.3统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行正态性检验，偏态资料行LOG转换。两独立组间的比较用成组t检验，多组间比较用单因素方差分析，多重比较为LSD-t检验。计数资料以例数或率描述，组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CRC组与健康对照组外周血脂联素水平比较

两组间年龄、性别、BMI［BMI=体重（kg）/身高（m）2］比较，差异无统计学意义（P<0.05）。CRC组血清脂联素水平[（3.5±2.5）μg/ml]低于健康对照组[（4.6±2.1）μg/ml]，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1　CRC组与健康对照组各因素比较

2.2重组人脂联素对LoVo细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示，15和30 ng/ml重组人脂联素作用细胞24h，与0ng/ml细胞增殖活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但随着作用时间延长至48 h，30 ng/ml重组人脂联素对细胞增殖活性的影响与0 ng/ml比较，差异有统计学意义（P<0.05）。60和90ng/ml重组人脂联素对细胞增殖活性有抑制作用，与0ng/ml比较，差异有统计学意义（P<0.05）。重组人脂联素降低LoVo细胞活性，抑制细胞生长，且抑制作用与时间和剂量相关。见表2。

表2　不同浓度重组人脂联素蛋白对LoVo细胞增殖的影响（n=6，ng/ml±s）

表2　不同浓度重组人脂联素蛋白对LoVo细胞增殖的影响（n=6，ng/ml±s）

注：抑制率资料经LOG转换后行参数分析。1）与24 h比较，P<0.05；2）与0 ng/ml比较，P<0.05；3）与15 ng/ml比较，P<0.05；4）与30 ng/ml比较，P<0.05；5）与60ng/ml比较，P<0.05

抑制率/% 24h24h48h 0ng/ml0.70±0.031.02±0.09t0.100.10 15ng/ml0.67±0.040.94±0.061）3.82±2.772）8.06±5.231）2）30ng/ml0.66±0.040.72±0.061）2）3）4.65±3.362）28.55±10.451）2）3）60ng/ml0.55±0.032）3）4）0.70±0.031）2）3）21.26±6.2242）3）3）30.42±6.731）2）3）90ng/ml0.51±0.022）3）4）5）0.67±0.031）2）3）27.63±5.542）3）4）34.46±6.582）3）整体分析HF系数0.98920.9521 F组间值44.70746.308 P组间值0.0000.000 F时间值609.23678.460 P时间值0.0000.000 F组间×时间值34.76116.737 P组间×时间值0.0000.000组别OD值48h

2.3不同浓度重组人脂联素作用LoVo细胞后对Caspase-3蛋白表达的影响

以不同浓度重组人脂联素分别培养细胞24 h，Western blot检测发现，30 ng/ml浓度时开始出现Caspase-3分解条带（分子量17 kD），且随着浓度逐渐增加，Caspase-3分解条带相对表达水平逐渐增加，各组间比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示重组人脂联素促进Caspase-3蛋白活化的作用呈浓度依赖性。见图1和表3。

图1　不同浓度重组人脂联素作用LoVo细胞后对Caspase-3蛋白表达的影响（±s）

表3　Caspase-3蛋白表达水平比较（n=6±s）

表3　Caspase-3蛋白表达水平比较（n=6±s）

注：t1、P1：0 ng/ml与15 ng/ml比较；t2、P2：0 ng/ml与30 ng/ml比较；t3、P3：0ng/ml与60ng/ml比较；t4、P5：0ng/ml与90ng/ml比较

脂联素浓度相对灰度值0ng/ml0.006±0.002 15ng/ml0.039±0.008 30ng/ml0.133±0.011 60ng/ml0.163±0.017 90ng/ml0.251±0.005 F值579.609 P值0.000 t1值5.712 P1值0.000 t2值22.029 P2值0.000 t3值27.211 P3值0.000 t4值42.370 P4值0.000

2.4同一浓度重组人脂联素作用LoVo细胞不同时间后对Caspase-3蛋白表达的影响

以60ng/ml重组人脂联素为实验浓度，分别培养细胞12、24和48 h，Western blot检测观察发现，重组人脂联素作用12h后出现Caspase-3分解条带（分子量17 kD），且随着作用时间逐渐延长，Caspase-3分解条带相对表达水平逐渐增加，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），提示重组人脂联素促进Caspase-3蛋白活化的作用具有时间依赖性。见表4和见图2。

表4　60ng/ml重组人脂联素作用LoVo细胞不同时间后的Caspase-3蛋白表达水平比较（n=6±s）

表4　60ng/ml重组人脂联素作用LoVo细胞不同时间后的Caspase-3蛋白表达水平比较（n=6±s）

注：t1、P1：0h与12h比较；t2、P2：0h与24h比较；t3、P3：0h与48 h比较

作用时间相对灰度值0h0.002±0.001 12h0.041±0.004 24h0.076±0.007 48h0.122±0.011 F值326.243 P值0.000 t1值9.721 P1值0.000 t2值18.477 P2值0.000 t3值30.007 P3值0.000

图2　60ng/ml重组人脂联素作用LoVo细胞不同时间后的Caspase-3蛋白表达±s）

3 讨论

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质，具有抗动脉粥样硬化、保护心血管系统、改善胰岛素抵抗、调节脂质代谢及抗炎等多种功能[6]。另外，脂联素还与肥胖相关的生殖、消化和内分泌系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关，具有重要的抗肿瘤效应[7]。而在结直肠癌中，KUMOR等[8]研究发现，血清脂联素水平在结直肠癌患者中明显下降。CHEN等[9]研究发现，血清高分子量脂联素（脂联素主要的活性形式）明显增加男性结直肠癌的发生风险。多项研究发现，血清脂联素水平与结直肠癌发病风险呈负相关[10-12]，且随着肿瘤分期的增加而降低[13]。本研究发现，结直肠癌患者外周血脂联素水平低于健康对照组，提示血清脂联素水平与结直肠癌发病有一定的相关性，支持血清脂联素浓度的降低是结直肠癌发病的危险因素的研究论点。

脂联素在结直肠癌发病过程中的具体作用机制尚未明确。以往文献发现，体外实验中脂联素能够明显抑制前列腺癌细胞株的生长[14]；且脂联素对多种人乳腺癌细胞具有抑制其增殖的作用，生理浓度的脂联素能够有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，并且继续给予脂联素，可以使细胞生长停滞甚至引起细胞的凋亡[15]。本研究采用不同浓度的重组人脂联素作用细胞不同时间后，结果发现，30 ng/ml重组人脂联素作用48 h或60 ng/ml作用24 h能够明显降低结直肠癌LoVo细胞的增殖活力，且其抑制效果随着浓度和时间的增加而增强，有较良好的时效和量效关系。本研究结果提示，脂联素具有抑制细胞增殖的作用，这可能是血清脂联素水平降低与结直肠癌发病风险增高相关的一个重要因素。

Caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶[16]。Caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。其中Caspase-3是家族中关键的凋亡蛋白酶，其激活可以水解特异性细胞蛋白和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶。研究发现，脂联素能够抑制胰腺癌Pan-2细胞的增殖，且该过程伴随细胞凋亡增加和Caspase-3的活化[17]。本研究检测脂联素作用结直肠癌LoVo细胞后，细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平，结果发现，30ng/ml脂联素作用24 h或60 ng/ml脂联素作用12h后，能够检测出活化的Caspase-3，并且表达水平随着浓度升高和作用时间的增加而逐渐加强。本研究提示，脂联素可能通过激活Caspase-3蛋白，导致结直肠癌LoVo细胞发生凋亡。

综上所述，血清脂联素水平与结直肠癌发病风险密切相关，血清脂联素浓度降低是结直肠癌发病的危险因素。脂联素能够抑制结直肠癌细胞LoVo增殖，并且脂联素可能通过激活Caspase-3而诱导结直肠癌细胞凋亡，为重组人脂联素治疗结直肠癌患者提供新的思路。

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（童颖丹编辑）

Expression of adiponectin in patients with colorectal cancer and its influence on colorectal cancer cell proliferation and caspase-3 expression

Han-bing Xie1，Yun-zhan Xia1，Jian-feng Xue2，Da-yong Yang1
（1.Department of General Surgery，Zhengzhou People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450053，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

Objective To detect the serum adiponectin level in patients with colorectal cancer（CRC），and to observe the effect of adiponectin on colorectal cancer LoVo cell proliferation and apoptosis-related protein caspase-3，andpreliminarilydiscussthemechanism.MethodsELISAwasusedtodetecttheserum adiponectin levels of colorectal cancer group and healthy control group.CCK 8 test was used to detect the influence of recombinant human adiponectin on LoVo cell proliferation.Western blot was adopted to detect the effect of recombinant human adiponectin on caspase-3 protein expression.Results The serum adiponectin level in the CRC patients［（3.5±2.5）μg/ml］was lower than that of the control group［（4.6±2.1）μg/ml］，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group，recombinant human adiponectin significantly inhibited proliferation of LoVo cells（P＜0.05）.Adiponectin significantly increased the expression of activated caspase-3 in the cells in a dose-and time-dependent manner.Conclusions Serum adiponectin level is closely associated with colorectal cancer risk.Recombinant human adiponectin can inhibit the proliferation of LoVo cells，and the effect is time-and dose-dependent.Its mechanism may be associated with caspase-3 activation.

colorectal cancer；adiponectin；cell proliferation；caspase-3

R 735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.010

1005-8982（2016）19-0047-05

2015-12-11