超高效液相色谱法测定人体血清中伏立康唑药物浓度*

杨婷，陈璐璐，胡伟，朱熙，刘丽萍，杨雅茹

（安徽医科大学第二附属医院药剂科，安徽 合肥 230601）

超高效液相色谱法测定人体血清中伏立康唑药物浓度*

杨婷，陈璐璐，胡伟，朱熙，刘丽萍，杨雅茹

（安徽医科大学第二附属医院药剂科，安徽 合肥 230601）

目的采用超高效液相色谱法测定人血清中伏立康唑（VR C）浓度，并用于临床上该药的血药浓度监测。方法以地西泮为内标，色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6×100mm，2.7μm），流速1ml/min，流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液（45∶55），检测波长254nm，进样量10μl，柱温40℃。结果VR C及地西泮的保留时间分别为2.52和4.06min；血清中VR C线性范围为0.12～12.0μg/ml（r=0.9999），定量下限为0.12μg/ml，日内精密度相对标准偏差（R SD）均<1.9%，日间精密度R SD均<2.1%，低、中、高3个浓度方法回收率为98.39%、101.16%和96.63%。结论该方法用于VR C的血药浓度检测，具有操作简便、稳定性良好，节约时间等优点。

伏立康唑；超高效液相色谱法；血药浓度监测

近年来，随着广谱抗生素的广泛使用、器官移植手术和侵入性诊疗手段的开展，侵袭性真菌感染的发病率正迅速增长，尤其是曲霉菌和念珠菌是最常见的致病菌。伏立康唑（Voriconazole，VRC）作为一种三唑类广谱抗真菌药，对于曲霉菌及念珠菌均有良好的抗菌作用，临床使用较为广泛[1]。但有研究发现，患者在给予相同剂量的伏立康唑时，体内血药浓度差异较大[2]。这可能与伏立康唑的药动学特点、药物间相互作用，以及药物代谢酶基因多态性等因素相关[3]。而血药浓度的巨大差异往往会影响疗效，引发不良反应。有文献报道，伏立康唑的安全浓度范围为1.0～5.5mg/L。当血药浓度>5.5mg/L时，不良反应如肝功能损害、视觉变化的发生率将大大增加。而血药浓度<1 mg/L时，可能出现治疗失败[4]。为提高伏立康唑临床应用的安全性及有效性，实现个体化给药，本实验建立超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）检测伏立康唑的血清药物浓度，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1实验仪器与试剂

Waters UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪，双量程电子天平，超纯水器，高速离心机，振荡器。伏立康唑对照品（中国药品食品检定研究院，批号：100862-201402，含量约99.7%），地西泮对照品（批号：171225-200903，含量为99.9%），甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯。

1.2色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6× 100mm，2.7μm），流速1ml/min，流动相为乙腈，0.2%甲酸水溶液（45∶55），进样量10μl，检测波长254nm，柱温40℃。

1.3溶液的配制

精密称取伏立康唑对照品2.4 mg，用50%甲醇水溶液定容到10 ml容量瓶中，制成240.0μg/ml伏立康唑储备液。然后依次稀释成伏立康唑标准曲线浓度点的储备液，浓度分别为120.0、60.0、24.0、12.0、6.0、2.4和1.2μg/ml。再取一定量的伏立康唑储备液稀释为质控样品的储备液，浓度分别为80.0、40.0和3.0μg/ml。

精密称取地西泮标准品1.0mg，用50%甲醇水溶液定容于1 ml容量瓶中，制成1 000μg/ml地西泮储备液，吸取该储备液150μl，加入50%甲醇水至10ml，得到15μg/ml内标溶液，备用。

1.4血清样品的处理

精密量取血清220μl，加入20μl内标地西泮溶液（15μg/ml），涡旋30 s，加入3 ml乙酸乙酯，震荡涡旋1 min，4 000 r/min离心10 min。精密吸取上层清液2.7 ml，40℃氮气吹干，加入50%甲醇水溶液250μl复溶，过0.22μm滤膜，10μl进样。

2 结果

2.1标准曲线和定量下限

取空白血清200μl，分别加入伏立康唑各标准曲线的储备液20μl及内标储备溶液20μl，配制成伏立康唑浓度分别为0.12、0.24、0.60、1.20、2.40、6.00和12.00μg/ml的系列标准血清样品，按1.4的方法操作，以色谱图中伏立康唑峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（Y），伏立康唑浓度为横坐标（X），得到线性回归方程：Y=0.1553X+0.0116，r2= 0.99997，线性范围为0.12～12.0μg/ml，定量下限为0.12μg/ml。

2.2方法专属性

分别取不同来源的空白血清、对照品血清及患者服药后血清样本各6份，按1.4方法操作。色谱峰分离良好，不受血清内源性杂质峰干扰，伏立康唑和地西泮的保留时间分别为2.52和4.06min。见附图。

2.3精密度试验

配制伏立康唑低、中、高3个浓度的血清样品，浓度分别为0.3、4.0和8.0μg/ml，每个浓度配制6份，按1.4方法操作，得到该方法的日内精密度。连续检测3d，得到该方法的日间精密度。见表1。

附图　UPLC图谱

表1　UPLC法检测伏立康唑血药浓度的精密度

2.4回收率试验

配制伏立康唑低、中、高3个浓度的血清样品，浓度分别为0.3、4.0和8.0μg/ml，每个浓度配制6份，按1.4方法操作。另外取同等量的3个不同浓度的伏立康唑对照品溶液直接进样，将前者与后者的峰面积比较，计算提取回收率。根据当日标准曲线求得实测浓度，并与理论浓度进行比较作为方法回收率。见表2。

2.5稳定性试验

2.5.1室温稳定性配制伏立康唑为0.3、4.0和 8.0μg/ml的低、中、高3个浓度的血清样品，室温放置6h后按1.4方法操作。将测得结果与0h进行比较，结果表明血清样品室温放置6h保持稳定。

2.5.2进样室放置稳定性方法同2.5.1，配制伏立康唑3个浓度的血清样品，按1.4方法处理，进样室放置20 h后检测，结果表明血清样品处理后进样室放置20h保持稳定。

2.5.3冻融条件下血清样品的稳定性方法同2.5.1，配制伏立康唑3个浓度的血清样品，置于-80℃冰箱冷冻后，取出在室温下解冻，反复冻融3次，然后按1.4方法操作，将测得结果与未冻融样品进行比较，结果表明，血清样品反复冻融3次仍保持稳定。

表2　伏立康唑浓度分析方法的提取回收率和方法回收率（n=6，%s）

表2　伏立康唑浓度分析方法的提取回收率和方法回收率（n=6，%s）

理论浓度提取回收率方法回收率0.3μg/ml94.32±0.0198.39±0.02 4.0μg/ml83.07±0.01101.16±0.02 8.0μg/ml100.12±0.0196.63±0.02

2.5.4长期稳定性配制伏立康唑浓度为0.3、4.0和8.0μg/ml的低、中、高3个浓度的血清样品，在-80℃冰箱冷冻20 d后，取出在室温下解冻，按1.4方法操作，测得结果表明血清样品长期冰箱中放置仍保持稳定。见表3。

表3　伏立康唑浓度分析方法的稳定性（n=6）

2.6方法学应用

应用该方法对本院10例患者进行伏立康唑血药浓度测定，具体过程为患者连续使用伏立康唑，达稳态血药浓度时，于次日早晨用药前采血，4000r/min离心10 min，精密量取血清220μl，根据1.4方法处理，依据标准曲线定量。从监测结果来看，除7号外，其他血药浓度均在有效治疗浓度范围内（0.25～6.00mg/L）。7号和9号为同一患者血样，7号给予常规剂量药物，血药浓度超出有效浓度范围，9号为给药剂量较前一次减半后测得的血样，测得浓度降低至有效浓度范围。见表4。

表4　患者临床资料及伏立康唑血药浓度

3 讨论

多项研究结果表明，伏立康唑的血药浓度与其疗效及安全性相关[4-5]。有文献报道，伏立康唑的代谢呈非线性药动学特性[6]，且在不同人体内的代谢快慢有明显差异，与本研究结果相符。由于患者血药浓度个体差异大，因此对伏立康唑进行血药浓度监测，可以更好地指导临床用药，对实现个体化给药意义重大。目前，测定伏立康唑的血药浓度常用方法有高效液相紫外检测法[7-9]、高效液相荧光检测法[10]和液质联用法[11-13]。本研究采用的是超高效液相色谱法，与高效液相检测方法比较，其检测速度快，每个样本仅需5 min即可得出结果，大大节省时间，满足临床检测需求；与液质联用法比较，其具有操作简便、成本低、重复性好的优点。BOEIRA等[14]也曾报道，使用超高效液相色谱法检测伏立康唑的血药浓度，相比较而言，该法优化液相条件，流动相中不含有缓冲盐溶液，延长色谱柱的寿命。同时，该法内标为地西泮，简单易得，便于实际操作。本实验中分别应用0.05%、0.10%、0.30%和0.20%甲酸水溶液作为水相，前3种溶液导致色谱图基线漂移，并且连续进样稳定性差，0.20%甲酸水溶液作为水相避免上述情况的出现。在选择血清样品处理方法时，分别使用甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸等试剂沉淀蛋白，离心后吸取上清液过滤直接进样的方法，回收率较低且杂质干扰较大。尝试使用乙酸乙酯提取的方法，实验结果表明，该方法样品回收率高且杂质干扰小，待测物峰形良好，适用于临床伏立康唑血药浓度测定。

本研究建立的方法实用性强，操作简便、数据准确、灵敏度高、重复性好，可以作为伏立康唑血药浓度日常监测方法，为临床合理安全用药提供有力的依据。

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（童颖丹编辑）

Determination of serum Voriconazole concentration by ultra performance liquid chromatography*

Ting Yang，Lu-lu Chen，Wei Hu，Xi Zhu，Li-ping Liu，Ya-ru Yang
（Department of Pharmacy，the Second Hospital of Auhui Medical University，Hefei，Anhui 230601，China）

ObjectiveTodeterminatetheconcentrationofVoriconazoleinhumanserumbyultra performance liquid chromatography（UPLC）.Methods Chromatography was performed on Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6×100 mm，2.7 μm），the internal standard was Diazepam.The flow rate was 1 ml/min，the mobile phase was acetonitrile-water（0.2%formic acid）（45：55），and the detection wavelength was 254 nm.Injection volume was 10 μl and the column temperature was 40℃.Results The retention time of Voriconazole and the internal standard Diazepam was 2.52 min and 4.06 min，respectively.The calibration curve was linear over the concentration range of 0.12-12.0 μg/ml（r=0.9999）with the lower limit of quantitation（LLOQ）at 0.12 μg/ml. Intra-and inter-day RSD was below 1.9%and 2.1%，respectively.The extraction recovery rate of the low，medium and high concentrations was 98.39%，101.16%and 96.63%，respectively.Conclusions The UPLC is a simple，highly selective and sensitive method for determining serum level of Voriconazole.

Voriconazole；ultra performance liquid chromatography；therapeutic drug monitoring

R 969.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.008

1005-8982（2016）19-0037-05

2016-05-11

安徽医科大学第二附属医院博士科研启动基金（No：2012BKJ022）；安徽医科大学科学研究基金（No：2015xkj020）

胡伟，E-mail：ay2fyhuwei@qq.com；Tel：13856086475