6株光合细菌的分离及水质净化效果的研究

刘样珍　凌梅燕　史宝军（1.清远海贝生物技术有限公司，清远511853；2.广东海大集团海大研究院，广州511400）

6株光合细菌的分离及水质净化效果的研究

刘样珍凌梅燕史宝军
（1.清远海贝生物技术有限公司，清远511853；2.广东海大集团海大研究院，广州511400）

采用半固体试管法和厌氧培养法从对虾养殖泥中富集筛选出6株光合细菌，分别编号为PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6，并对其降解水体氨氮、亚盐、硫化物方面进行探讨。结果表明，6株光合细菌对氨氮的最高降解率达到93.21%，对亚盐的最高降解率达到99.84%，对硫化物最高降解率为50%。最终确定3株对3种有害物质均有降解效果的光合细菌，为后续复合菌株提供实验依据。

光合细菌；氨氮；亚盐；硫化物

随着我国水产养殖的发展，高密度养殖规模日益扩大，养殖水体常因池中残饵、水生生物排泄物及尸体等的腐烂、分解，导致水质恶化，使水体中营养元素N、P等发生非正常变化并产生氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质，致使养殖生态环境严重恶化。非离子态的氨氮对养殖对象可以直接产生毒性，影响其生长和发育。在养殖旺季，由于气温高，导致异氧微生物大量繁殖，有机物被分解，释放出大量的氨，硫化氢等有害物质，从而影响鱼虾的生长、发育，引起鱼虾的疾病。光合细菌是一类以光为能源，能以自然界中有机物、硫化物等为营养，并能进行光作用的微生物，可将养殖池底由鱼虾排泄物、食物残饵产生的氨氮等有毒物质有效的降解。本实验从对虾池塘底泥筛选获取6株光合细菌，并探讨6株光合细菌水体中有害物质的净化作用，寻找能同时降解有害物质并具有协同作用的菌株，为降解养殖水体中的有害物质。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源

广州市海鸥岛对虾养殖池塘

1.1.2仪器设备

显微镜（CX-31）、灭菌锅、平板、pH计（pHS-3C）、紫外分光光度计（UV-1800）、低温冷冻高速离心机等。

1.1.3培养基

分离培养基：CH3COONa·3H2O 2g/L、CH3CH2COONa 2g/L、NaCl 1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.2 g/L、FeSO410 mg/L、酵母膏1 g/L、CaCl20.0057g/2L、Na2CO30.0315g/2L、琼脂15g/L；

富集及扩大培养基：CH3COONa·3H2O 3g/L、NaCl1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.2g/L、KH2PO40.5g/L、FeSO40.01g/L、CaCl20.0028g/L、Na2CO30.0157g/L。

1.2方法

1.2.1样品富集培养

将200mL灭菌后的富集培养基倒入三角瓶中，与底泥搅匀，加入灭菌的液体石蜡以隔绝空气。置于温度为28～32℃、光照为2 000～3 000 lux的条件下培养，当富集液颜色变红时，取菌膜及富集液转接入另一装有富集培养基的100 mL盐水瓶瓶中培养，接种量为5%～10%，如此转接4～5次。

转基因食品安全问题。2012年湖南转基因大米试验、孟山都转基因玉米致癌风波，2013年“崔方论战”事件，2014年恒大推出非转基因广告造势活动等，一度将转基因食品安全问题推上风口浪尖。所以，目前人们最大的关注点是转基因食品的饮食安全以及生态安全。

1.2.2分离纯化

根据富集液浓度用1 mL移液管取不同稀释度的富集液液加到灭菌的试管中，后加入18～20 mL灭菌的40℃光合细菌分离培养基，琼脂含量0.8%；培养基冷凝后上层加5 mL灭菌的45℃2.0%的琼脂，用保鲜膜封口。冷却后置于白炽灯下培养，培养温度为30℃，光照强度为2 000～3 000lux，直至长出红色单菌落。待单菌落长出后用厌氧培养法纯化，划线纯化3～4次，镜检无杂菌后挑取红色单菌落至10 mL液体培养基中培养，再逐步扩大培养。

1.2.3菌落及菌体形态观察

以琼脂平板上的菌落形态描述，菌体形态以电子显微镜描述。

1.2.4标准曲线的制作

PSB以10%的接种量接种后，从0～132h开始检测PSB的OD值的变化情况，36 h前每隔6 h取样检测，36 h后每隔4 h取样检测变化情况。

1.2.56株PSB对水体中亚硝酸盐、氨氮、硫化物的降解作用

试验分别在水体中添加1g/L的亚硝酸盐、氨氮及硫化物，实验组投入10%的PSB，对照组不加PSB菌液，试验设3个平行，4 d后测OD值，测定前先将PSB液10000 r/min，10 min离心取上清液测定OD值；

表1　分离菌株的形态特征

2　结果与分析

2.1富集分离

对虾池塘底泥富集7～10天后，培养液变红，重复富集,取呈深红色的富集液进行稀释,经多次半固体培养法和厌氧培养法获得6株光合细菌，分别命名为PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6。

2.2菌体形态

2.36株光合细菌的生长曲线

图1　PSB-1（1000×）　

图2　PSB-2（1000×）

图3　PSB-3（1000×）　

图4　PSB-4（1000×）

图5　PSB-5（1000×）　

图6　PSB-5（1000×）

图7为6株光合细菌的生长趋势，从图中可看出6株光合细菌的趋势是一致的。0～6 h是为迟滞期，6～54 h是对数生长期，54～132 h是稳定期，部分菌株在102 h后出现衰亡。96 h菌株已进入稳定期，对各种有害物质的降解也趋于稳定，故选择96 h作为检测光合细菌降解有害物质的时间点。

图7　6株光合细菌生长趋势

2.4光合细菌对氨氮的降解

实验结果表明，11株光合细菌对于培养基中的氨氮都有降解作用，其中PSB-4对氨氮降解能力最强，从401.2 mg/L降解到27.25 mg/L，降解率达到93.21%，其次是PSB-2对氨氮的降解率为58.68%，PSB-5和PSB-6对氨氮的降解率约为55%，PSB-1及PSB-3的降解率约为33%。

图8　6株光合细菌接种4天后对氨氮的降解

2.5光合细菌对亚盐的降解

由图9可知，PSB-1和PSB-2对亚盐的降解率为99.84%，PSB-3对亚盐的降解率为 58.94%，PSB-5和PSB-6对亚盐的降解率约为52%，而菌株PSB-4反而上升。

2.6光合细菌对硫化物的降解

从图10可知，PSB-1对硫化物的降解率为50%，PSB-5对硫化物的降解率为44.95%，PSB-2和PSB-6对硫化物的降解低于20%，而PSB-3和PSB-4在接种当天快速地降解硫化物，而后又升高，其原因还需要进一步的实验分析。

图9　6株光合细菌接种4天后对亚盐的降解

图10　6株光合细菌对硫化物的降解

3　小结与讨论

PSB的分离培养常采用厌氧培养法、双层平板法和半固体试管培养法，光的波长和光照强度对于光合菌培养影响较大。本研究发现利用厌氧培养法筛选光合细菌的效果优于半固体试管法，该方法相对半固体培养法便于挑取单菌落制备液体种子，且比半固体培养法的培养周期短，可能与厌氧程度相关。

PSB不同菌株的生理功能差异较大。本实验从池塘底泥及市售样品中分离筛出6株光合细菌，PSB-3和PSB-4不具备降解硫化物的能力，其余均具有降解氨氮、亚盐、硫化物的能力，其中PSB-1、PSB-2、PSB-5都具有较好的降解水体中有害物质的能力。通过对几株光合细菌菌株的降解实验分析，进一步组合复合菌株。刘敏等在研究混菌发酵对光合细菌生长及氮磷同化率指出粪红假单胞菌自身生长能力较沼泽红假单胞菌强，混菌培养后两种光合细菌对培养基中氮磷的同化能力明显增强，较对照组的沼泽红假单胞菌同化率提高19.89%。

PSB-3及PSB-4对硫化物的利用出现升高的情况，刘磊等在研究光合细菌降解水体中硫化物出现含量升高的情况，原因可能与光合细菌抑制硫化物的作用机制有关，一是水体环境中硫酸盐含量高，硫酸盐的还原是H2S的主要来源。二是由于氧的供应不足，硫蛋白的分解过程产生了H2S。

（略）

S917.1

A

1005-8613（2016）09-0022-03

2016-8-29

刘样珍，（1989-），女，广东韶关，研发专员，主要从事微生态制剂研究。