电针对膝骨关节炎MIA模型大鼠软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响

寿崟,刘苗苗,周俊梅,刘素君,徐斯伟,杨洋,张开勇,张必萌



电针对膝骨关节炎MIA模型大鼠软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响

寿崟1,2,刘苗苗2,周俊梅2,刘素君2,徐斯伟2,杨洋2,张开勇2,张必萌2

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海交通大学附属第一人民医院,上海 200080)

目的 观察抑制Ⅰ型胶原蛋白基因表达是否为电针改善膝骨关节炎的作用机制之一。方法 将40只成年SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、药物组和电针组,每组10只。采用注射单体碘乙酸钠(MIA)并驱赶大鼠运动来建立膝骨关节炎MIA模型,药物组造模后采用塞来昔布溶入到10%DMSO中进行灌胃,电针组采用电针足三里、阳陵泉治疗。比较各组大鼠治疗前后痛阈及软骨组织内Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平的变化情况。结果 模型组、药物组及电针组大鼠造模后痛阈与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。药物组和电针组大鼠处死前痛阈与模型组比较,差异均具有统计学意义 (＜0.01)。药物组大鼠处死前痛阈与电针组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。模型组、药物组及电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。药物组和电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与药物组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。结论 电针与药物对治疗膝骨关节炎的作用机制可能与抑制Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达有关。

针刺;电针;骨关节炎,膝关节;单体碘乙酸钠;Ⅰ型胶原蛋白

膝关节是骨关节炎的好发部位,膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)以膝关节疼痛、僵硬、活动受限为主要特征,患者常因关节疼痛而求治[1-3]。针灸是世界公认治疗KOA的优选替代疗法,具有安全、有效、副反应小等优点[4-6]。临床实践表明,针灸对改善KOA的关节疼痛、肿胀、畸形及活动受限等临床症状方面疗效显著[7]。本课题组前期实验研究[8-9]也表明,针灸能较好地缓解局部的肿胀和疼痛,促进KOA患者关节渗出液的吸收,改善患者关节周围的血液循环,消除炎症反应,而且对骨赘有明显的改善作用,但其具体起效机制尚不明确。研究表明,在正常的软骨中Ⅰ型胶原蛋白的含量甚微,已有研究发现在骨性关节炎模型关节软骨中Ⅰ型胶原蛋白含量增加[10-11]。本实验旨在通过观察电针治疗KOA MIA模型大鼠过程中软骨组织中的Ⅰ型胶原基因表达的变化,研究电针对Ⅰ型胶原蛋白的调控机制,为电针治疗KOA的可能作用机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组及处理

40只成年SD雄性大鼠,体重为(280±20)g,由上海交通大学附属第一人民医院动物实验中心提供[实验动物许可证号SCXK(沪)2003-0003]。SD大鼠在实验前适应性驯养10 d。所有实验动物在相同标准环境(GB14925-2001)下饲养与实验,予以自然照明、饮水和饮食。实验前于每日同一时间将大鼠放在测痛仪的玻璃罩内进行测痛环境适应。采用查随机数字表法将40只大鼠随机分为正常组、模型组、药物组和电针组,每组10只。各组在造模前、造模后2星期(治疗前)及治疗后各检测痛阈1次,随后处死动物并取材。所有实验方法均经上海交通大学附属第一人民医院动物伦理委员会通过。

1.2 主要试剂与仪器

碘乙酸钠(MIA)、Trizol、二甲基亚砜(DMSO)试剂(美国Sigma公司),水合氯醛(国药集团上海化学试剂有限公司)。

TF型光热测痛仪(中国医学科学院药物研究所)、韩氏LH202H穴位电针仪(中国北京华卫有限公司)、塞来昔布胶囊(美国辉瑞制药有限公司)。其他涉及的试剂及仪器均由上海交通大学附属第一人民医院实验中心提供。

1.3 造模与治疗方法

除正常组外,其余各组大鼠在造模前检测痛阈后,以水合氯醛(40 mg/kg,腹腔注射)麻醉,将0.3 mg单体碘乙酸钠(monomer sodium iodic acid, MIA)溶液注入大鼠左侧膝骨关节腔内,并配合持续的抽屉样关节运动。具体操作步骤为,将3 mg MIA溶入到50mL0.9%的生理盐水中,清理关节附近的鼠毛,将关节屈曲到最大限度后于左膝关节腔注入配置好的溶液,于右膝处注入同等剂量的生理盐水。正常组用同样的方法于两膝注入50mL生理盐水。所有老鼠每日同时做相同的驱赶运动约30 min。

电针组于造模的同时予以电针治疗。取足三里、阳陵泉穴。穴位定位参照《实验动物针灸穴位图谱》。常规消毒后,采用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.25 mm×40 mm毫针进行针刺,得气后接穴位电针仪,采用疏密波形,频率为2/100 Hz,强度为1～3 mA,串长为30 s,每10 min递增1次,持续30 min,以局部肌肉轻微抖动为度。每日1次,连续治疗14 d。

药物组于造模的同时予以药物治疗。将塞来昔布胶囊溶入到10%的DMSO中,给予每只大鼠3 mg/kg的灌胃量。每日1次,连续治疗14 d。

1.4 痛阈检测方法

在适宜温度、湿度及安静的环境下,采用热辐射法,以TF型光热测痛仪辐射热照射大鼠尾部(距尾尖1.0 cm处)至出现甩尾反射潜伏期(S)为痛反应值。每次测量重复3次,间隔5 min,3次测量结果的平均值作为1次耐痛阈值,测量均于下午进行。

1.5 取材

实验结束后,称量各组大鼠体重,麻醉后固定于手术台,伸直关节,切开皮肤,将整个关节取下摄像保存并作大体观察。切开皮下组织、深筋膜,切断内外侧副韧带,显露出整个膝关节面,肉眼观察膝关节面,关节软骨变化并摄像保存。将膝关节置于冰上,用锐利刀片取膝关节正中部分的软骨组织约50 mg,去除周围的脂肪组织,剪碎分装置于1.5 mL的离心管中,加入Trizol试剂0.5 mL手动匀浆器搅碎组织,于4℃下1000离心20 min,提取上清液置于4℃下保存备用。

1.6 RT-PCR反应

Ⅰ型胶原蛋白的引物序列为5’-ATGTCTGGTTTG GAGAGAGCA-3’,5’-GAGGAGCAGGGACTTCTTGAG-3’,长度为138 bp;内参为GAPDH,引物序列为5’-CCGAGGGCC CACTAAAGG-3’,5’-GCTGTTGAGTCACAGGAGCAA-3’,长度为116 bp。于PCR仪(美国ABI-7500)内扩增。扩增条件为70℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 10 min,94℃ 15 s,60℃ 34 s,72℃ 15 s,共45个循环。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS Software分析,用2-ΔCT×100%(ΔCT＝目标基因CT值－内参GAPDH CT值)表示mRNA相对表达量作为统计值。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS16.0软件进行统计处理,正态分布资料以均数±标准差表示,用单因素方差分析、检验进行统计学处理。偏态分布资料采用中位数(M)和四分位数间距(Q1,Q2)表示,组间比较用秩和检验。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点痛阈比较

由表1可见,各组大鼠造模前痛阈比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。模型组、药物组及电针组大鼠造模后痛阈显著下降,与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示造模成功。药物组和电针组大鼠处死前痛阈显著上升,与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。药物组大鼠处死前痛阈与电针组比较,差异无统计学意义(＞0.05),提示电针与药物均具有对抗关节炎性疼痛的作用。

表1 各组大鼠不同时间点痛阈比较 (±s,s)

表1 各组大鼠不同时间点痛阈比较 (±s,s)

组别n造模前造模后 处死前 正常组10 9.91±1.149.86±0.9810.22±1.22 模型组1010.17±1.02 7.62±0.611) 7.33±1.061) 药物组10 9.83±0.99 7.94±0.601) 9.86±1.182) 电针组1010.57±1.21 7.63±0.641) 10.16±0.982)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.2 各组大鼠软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平比较

由表2可见,模型组、药物组及电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示Ⅰ型胶原蛋白与炎症痛相关,在骨关节炎早期Ⅰ型胶原蛋白就有大量表达。药物组和电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示药物及电针的镇痛作用与Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达降低相关。电针组大鼠Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达与药物组比较,差异无统计学意义(＞0.05),提示电针与药物在对于抗关节炎症方面疗效相近。

表2 各组大鼠软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平比较 (±s,%)

表2 各组大鼠软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平比较 (±s,%)

组别n COLLA-I mRNA相对表达量 正常组101.6407±0.3661 模型组10 6.2727±1.48071) 药物组10 3.1372±0.90611)2) 电针组10 2.9595±1.56311)2)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

3 讨论

骨关节炎是一种可以致残的疾病,主要发生在关节部位,尤其是承重关节,如髋关节和膝关节,其特点是这些部位的组织疼痛和退行性改变[12]。目前关于软骨胶原蛋白的研究一直被认为是揭示骨关节炎的重要突破口之一[13-14]。关节软骨是骨表面的一层间质丰富、细胞少的黏弹性物质,主要由胶原蛋白及蛋白聚糖等成分组成。在骨性关节炎早期,软骨细胞所生存的微环境正逐渐发生改变,某种条件发生改变诱导软骨细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌增加,产生的Ⅰ型胶原蛋白不断向周围细胞内传递并放大外界环境改变的信号,促进软骨细胞表型的变化,加速软骨的退变[15]。

大量国内外临床研究[4,7]表明,电针在治疗KOA方面有其独特优势,能够有效缓解KOA引起的疼痛、关节僵硬及功能性障碍。临床上,针灸治疗KOA多以局部疏通经脉、调理气血为主,电针局部足三里、阳陵泉可有效改善膝关节局部的血液循环,减轻滑膜炎症,起到防卫免疫、抗病镇痛的作用,有利于关节炎的恢复。

本实验采用分子生物学方法对电针治疗大鼠KOA MIA模型进行了研究,并对电针疗法的可能作用机制进行探讨,证明了电针能够有效纠正Ⅰ型胶原蛋白在软骨组织中的异常表达,从而发挥治疗作用,为针灸治疗KOA提供了可靠的实验证据。

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Effect of Electroacupuncture on Cartilage Expression of Type ⅠCollagen Gene in a Rat Model of MIA-induced Knee Osteoarthritis

1,2,-2,-2,-2,-2,2,-2,-2.

1.,201203,; 2.’,200080,

Objective To investigate whether inhibiting the expression of type Ⅰ collagen gene is one of the mechanisms of action of electroacupuncture in improving knee osteoarthritis. Methods Forty male adult SD rats were randomized into normal, model, medication and electroacupuncture group, 10 rats each. A rat model of MIA-induced knee osteoarthritis was made by injecting monomer sodium iodoacetate (MIA) and driving rat movement. After model making, the medication group received an oral gavage of celecoxib dissolved in 10% DMSO and the electroacupuncture group, electroacupuncture at points Zusanli and Yanglingquan. Pain thresholds and the levels of cartilage expression of type Ⅰ collagen mRNA were compared between various groups of rats before and after treatment.Results There was a statistically significant difference in pain threshold between the model, medication or electroacupuncture group of rats and the normal group after model making (＜0.01) and between the medication or electroacupuncture group of rats and the model group before sacrifice (＜0.01). There was no statistically significant difference in pain threshold between the medication and andelectroacupuncture groups of rats before sacrifice (＞0.05). There was a statistically significant difference in the expression of type Ⅰ collagen mRNA between the model, medication or electroacupuncture group of rats and the normal group (＜0.01) and between the medication or electroacupuncture group of rats and the model group before sacrifice (＜0.01). There was no statistically significant difference in the expression of type Ⅰ collagen mRNA between the electroacupuncture and medication groups of rats before sacrifice (＞0.05). Conclusion The mechanisms of actions of electroacupuncture and medication in treating knee osteoarthritis may be related to inhibiting the expression of type Ⅰ collagen mRNA.

Acupuncture treatment; Electroacupuncture; Osteoarthritis, knee joint; Monomer sodium iodoacetate; Type Ⅰ collagen

1005-0957(2016)09-1119-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.09.1119

2016-04-13

上海市卫生局中医药科研项目(2010J007A);上海市第一人民医院院级课题(11B10);海派中医流派及特色技术扶持项目(ZYSNXD-CC-HPGC-FC-011)

寿崟(1984 - ),女,主治医师

张必萌(1974 - ),男,主任医师,Email:pjzhtiger08@ali yun.com