SgP5CS基因克隆和生物信息学分析

金杭霞，董德坤，王　伟，杨清华，朱丹华，*

(1.浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021；2.萧山区种子管理站，浙江 杭州 311201)



SgP5CS基因克隆和生物信息学分析

金杭霞1，董德坤1，王伟2，杨清华1，朱丹华1，*

(1.浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021；2.萧山区种子管理站，浙江 杭州 311201)

利用同源克隆的方法，获得了碱蓬P5CS基因全长ORF，命名为SgP5CS。SgP5CS ORF全长2 151 bp，生物信息学软件预测其编码716个氨基酸组成的多肽，相对分子量为77 431.8 u，等电点为5.71，为稳定的亲水性蛋白，无跨膜结构域。ClustalX多重序列比对发现SgP5CS编码的氨基酸序列与盐角草P5CS相似性为93%，与盐角草P5CS的亲缘关系最近，其次是甜菜。脯氨酸是生物体内重要的渗透调节剂，而Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶则是植物合成脯氨酸的关键酶之一，SgP5CS的克隆将为进一步的功能分析鉴定基础。

碱蓬；P5CS；脯氨酸

脯氨酸在植物体内起重要作用，不仅作为一种氨基酸构成了蛋白结构，还能以渗透调节剂身份起到维持细胞内水分、稳定亚细胞结构等作用。在植物体中，目前已知的脯氨酸合成途径有谷氨酸和鸟氨酸两条途径，而在植物遭受逆境环境时，谷氨酸途径是脯氨酸合成的主要途径[1-2]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS，EC 2.7.2.11/ 1.2.1.41)是谷氨酸合成途径中的限速酶，当植物受到胁迫诱导时，P5CS的反馈调节在控制植物脯氨酸的水平中起着重要作用[3-4]。目前已从烟草[5]、羊草[6]、桑树[7]、苜蓿[8]、苎麻[9]、高粱[10]等多种植物中克隆到编码该酶的基因，并且在拟南芥[11]、苜蓿[12]、小麦[13]、烟草[5]等植物中发现，过量表达P5CS基因能提高转基因植物体内脯氨酸含量，进而提高植物抗旱耐盐性能。碱蓬是一种能生长于海边滩涂的盐生植物，是研究植物耐盐机制、挖掘耐盐抗旱基因极好的材料。本研究利用同源克隆方法首次从碱蓬中获得了SgP5CS基因的完整ORF序列，并对该基因进行了生物信息分析，这将为后期该基因的功能验证奠定基础，有利于更清晰地认识P5CS基因功能和调控机制，最终为植物基因工程提供有效耐逆基因。

1　材料与方法

1.1材料与处理

碱蓬植株收集于浙江慈溪沿海滩涂，Hoagland营养液水培至植株高为20 cm左右时，采用200 mmol·L-1氯化钠(NaCl)处理1 d。

1.2方法

1.2.1碱蓬总RNA提取

采集200 mmol·L-1氯化钠(NaCl)处理1 d后的碱蓬嫩叶，采用Trizol(Solomon Biotechnology)法[14]提取总RNA，-70℃保存。

1.2.2碱蓬P5CS ORF全长序列的克隆

GenBank 数据库查找已发表的拟南芥等物种的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列，Clustalw2多序列比对后设计包含完整ORF的简并引物SgP5CS-F和SgP5CS-R(表1)。反转录试剂盒(TOYOBO公司)对总RNA进行反转录，合成cDNA第一条链。Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)进行PCR 扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并割胶回收，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收目的片段连接到pEASY-Blunt载体(TRANSGEN BIOTECH公司)上。连接产物转化大肠埃希菌 DH5α感受态细胞，IPTG和X-gal蓝白斑筛选，挑取白斑接种于5 mL LB(含 50 μg·mL-1氨苄青霉素)培养基中，37℃，200 r·min-1振荡培养过夜。PCR检测阳性克隆送至上海英骏公司测序。

表1碱蓬P5CS克隆所用引物序列

Table 1Primer sequences used in gene cloning of Suaeda glauca P5CS gene

引物名称引物序列(5'→3')作用SgP5CS-FATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGTcDNA全长克隆SgP5CS-RAGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAAcDNA全长克隆

1.2.3碱蓬P5CS的生物信息学分析

利用NCBI的ORF Finder在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找 P5CS的开放式阅读框，并翻译成氨基酸。在NCBI网站上进行BLASTp同源性分析；用ClustalX2 进行氨基酸序列的多重比对分析，用MEGA5软件构建系统进化树。Expasy软件包中的 ProtParam 工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的基本理化性质；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测跨膜结构域；CFSSP(http://cho-fas.sourceforge.net/index.php#)预测蛋白质二级结构;SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模蛋白质三级结构。

2　结果与分析

2.1碱蓬P5CS完整ORF的扩增

简并引物PCR 扩增产物的电泳结果显示(图1) ，在大约2 100 bp 位置有一条清晰的条带，与预计目的条带大小相符，经测序获得2 151 bp的核苷酸序列，BLAST对比其他植物P5CS基因序列相似度较高，ORF Finder软件确定其为完整ORF。碱基序列翻译后与盐角草、甜菜、雷蒙德氏棉等P5CS蛋白的氨基酸相似性达到80%以上，且氨基酸数量相同，确定克隆到的为碱蓬P5CS基因的完整ORF。

1:DNA Marker； 2:SgP5CS 基因cDNA扩增产物。图1　SgP5CS PCR产物凝胶电泳图Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS

2.2碱蓬P5CS基因编码产物的相似性和进化树分析

将碱蓬P5CS和盐角草、甜菜、葡萄和可可树氨基酸相似性达到79%以上的植物的P5CS蛋白进行相似性比对(图2)，结果表明：在氨基酸水平上碱蓬P5CS与藜科植物盐角草高度相似，相似性达到93%，与其他植物的相似性也很高(79%～82%)。

用MEGA 5软件构建氨基酸序列的系统进化树，从中可以发现，在氨基酸水平上，碱蓬P5CS与盐角草P5CS的亲缘关系最近，其次是甜菜，而与水稻、棉花等关系较远(图3)，这与植物分类学上的亲缘关系一致，碱蓬与盐角草、甜菜同属藜科植物。

2.3碱蓬P5CS基因编码蛋白质的结构与功能预测

NCBI的ORF Finder分析碱蓬P5CS基因的ORF序列发现其编码716个氨基酸，ProtParam软件预测其分子式为 C3407H5561N959O1046S23，原子总数为10 996，相对分子量为77 431.8 u，等电点为5.71，不稳定系数为35.36。因此，该蛋白分类为稳定蛋白。脂肪系数104.61，亲水性评估为-0.044，依据氨基酸分值越低亲水性越强的规律，该蛋白应为亲水性蛋白。

图2　碱蓬P5CS氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的多重序列比对Fig.2　Multialignment of amino acid sequences of SgP5CS and other P5CSs

图3　碱蓬SgP5CS蛋白的进化树Fig.3　Phylogenetic tree of the SgP5CS of Suaeda glauca

碱蓬SgP5CS三级结构的预测结果如图4所示。TMHMM软件检索发现SgP5CS蛋白无跨膜结构域，意味着SgP5CS不是跨膜蛋白。通过CFSSP在线工具预测蛋白二级结构显示，SgP5CS编码的氨基酸残基有 80.3%构成α-螺旋，33.8%构成β-折叠 ，12.8%构成无规则卷曲。

图4　碱蓬P5CS的三级结构Fig.4　Three-dimensional constitution of the P5CS of Suaeda glauca

3　讨论

脯氨酸是植物对抗逆境时有效的渗透调节剂，因此P5CS酶作为脯氨酸合成的关键酶之一，其编码基因被认为是植物重要的抗逆基因。在植物基因组内插入外源P5CS基因能提高植物非生物逆境下的抗性。徐博[14]从朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)中分离到PuP5CS基因，将其转化烟草后发现，在受到高盐和低温胁迫时，能够显著提高转基因烟草脯氨酸含量，以及叶绿素含量和可溶性糖含量。李鸿雁等[15]在羽衣甘蓝中过表达拟南芥AtP5CS1基因，明显改善了转基因植株的耐旱性。张霞等[16]在烟草中过表达OsP5CS基因，显著增加了转基因烟草脯氨酸含量及其非生物胁迫抗性。Zheng等[5]将AtP5CS和NtP5CS基因在大肠埃希菌中过来表达，均能提高大肠埃希菌对高盐、碱性、干旱、高温与冷害环境下的抗性。Chen等[17]将菜豆PvP5CS1和PvP5CS2基因分别转入拟南芥中，在盐胁迫下，转基因植株比野生型积累更多的脯氨酸，并表现出更强的耐盐性。Verdoy等[12]将豇豆的P5CS基因转入苜蓿基因组中，发现转基因植株组织中脯氨酸含量明显，转基因植株的抗旱性显著优于非转基因植株。目前已发表的文献表明，已克隆的P5CS基因在多种植物中都能发挥其增强植物非生物抗性的作用。这些研究结果将为转P5CS基因的抗旱耐盐植物真正运用于大田生产奠定坚实的基础。

本试验克隆了碱蓬P5CS酶的编码基因ORF片段，并获得了SgP5CS基因的重要的生物学信息。在今后的研究工作中，将通过对转基因拟南芥进行耐盐抗旱的生理生化分析，为进一步研究SgP5CS基因功能和作用机制，以及能否应用于改良高等植物的耐盐性方面提供理论依据。

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(责任编辑张韵)

Molecular cloning and bioinformatics analysis ofSgP5CS gene in Suaeda glauca

JIN Hang-xia1，DONG De-kun1，WANG Wei2，YANG Qing-hua1，ZHU Dan-hua1，*

(1.Institute of Crops and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou 310021，China；2.Seed Management Station of Xiaoshan District，Hangzhou 311201，China)

A new gene，named asSgP5CS，was cloned by homologous cloning method from Suaeda glauca.Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofSgP5CS gene was 2 151 bp，encoding 716 amino acids.The isoelectric point and the relative molecular weight of coded protein were 5.71 and 77 431.8 u，respectively.Hydrophobic analysis indicated thatSgP5CS was a hydrophilic protein and had no transmembrane domain.Nucleotide sequence Blast by ClustalX indicated that the coded protein ofSgP5CS shared an identity of 93% with P5CS of Salicornia europaea.Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) is a key enzyme in the synthesis of proline which is one of the important osmotic regulators in plants.Our research laid a foundation to further study the P5CS function in Suaeda glauca.

Suaeda glauca；P5CS；proline

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):395-399http://www.zjnyxb.cn

金杭霞，董德坤，王伟，等.SgP5CS基因克隆和生物信息学分析[J].浙江农业学报，2016，28(3)： 395-399.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.06

2015-06-29

中国博士后科学基金面上项目 (2014M551772)；国家转基因生物新品种培育重大专项 (2014ZX0800403B)

金杭霞(1983—)，女，浙江杭州人，博士研究生，助理研究员，从事基因功能研究。E-mail：jinhangxia@126.com

，朱丹华，E-mail：dhzhu@mail.zaas.ac.cn

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0395-05