武定鸡脂联素基因的PCR-RFLP分析

丁相红，吴培福，周杰珑，陈粉粉

（西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224）

武定鸡脂联素基因的PCR-RFLP分析

丁相红，吴培福，周杰珑，陈粉粉

（西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224）

采用PCR-RFLP方法对武定鸡67个个体的脂联素基因（NC_006096）第2外显子上的c.C565G突变位点进行多态性分析。MvaⅠ限制性内切酶对PCR产物进行单酶切，结果显示，在该位点有AA、AB和BB 3种基因型；对该位点的群体遗传学特性分析，经χ2适合性检验，表明在该位点群体处于平衡状态。

武定鸡；脂联素基因；PCR-RFLP

脂联素（adiponectin）是脂肪细胞特异性分泌的一种细胞因子，是至今发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白，是生物体能量平衡、葡萄糖和脂肪代谢以及摄食的重要调控因子［1］。脂联素基因作为重要疾病的候选基因在小鼠上研究较深入［2-4］，作为调控体脂沉积的候选基因，在猪、牛和家禽上均有报道［1，5-8］。

李生等［9］就AA鸡的脂联素基因表达，及其与皮下脂肪和腹腔内脂肪含量的关系做了研究，结果表明，其前期后期表现出不同的正负相关。黄煌［1］在研究固始鸡与安卡鸡资源群脂联素基因多态性及生长与肉质性状关联性时，发现了4个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与主要经济性状（屠宰率、半净膛率、腹脂重和腿肌重等）显著相关。该研究利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 （polymerase chain reactionrestriction fragmentlength polymorphism，PCRRFLP）技术对武定鸡脂联素基因在c.C565G的多态位点进行检测，以期为丰富武定鸡的遗传基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 该试验以采集自云南省武定县狮山镇、万德镇和高桥镇共67只武定鸡的血液样本为试验材料。翅静脉采血1～2mL，其中雌性个体37只，雄性个体30只，血样∶无水乙醇=1∶2保存，带回实验室于-20℃储存备用。

1.2 基因组DNA制备 采用北京全式金生物技术有限公司微量全血DNA提取试剂盒 （Easy Pure Blood Genomic DNA Kit，EE121）提取武定鸡血样基因组DNA，提取后的DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳检测和核酸蛋白分析仪测定浓度后，-20℃保存。1.3 引物设计 引物用Primer 5.0引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。设计3对脂联素引物扩增测序，分析测序结果，发现存在脂联素基因第2外显子上的c.C565G突变位点。 选用黄煌［1］发表的酶切引物 （F：5′-ACGAGCAGAACCACTACG-3′；R：5′-TGAGGTGCA GCAAGACAG-3′）进行酶切片段扩增。

1.4 PCR扩增反应 PCR的反应体系为25 μL：2×TaqMix12.5 μL；模板 DNA（10 pmol/μL）2.5 μL；上下游引物（10 pmol/μL）各 1.5 μL；用灭菌水补足至 25 μL。

PCR 反应程序为：94℃/5min；94℃/30 s、56 ℃/45s、72℃/30s，35 个循环；72℃/10min；16℃/∞。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测，Marker用 Trans2K Plus。

图2 PCR扩增电泳结果（204 bp）

表1 武定鸡脂联素基因第2外显子MvaⅠ-RFLP的基因型频率与等位基因频率

表2 武定鸡脂联素基因突变位点的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及χ2值

1.5 PCR扩增产物的RFLP分析 选用MvaⅠ限制性内切酶对PCR产物进行单酶切。酶切反应体系：10 μL PCR产物置于 0.2mL Eppendorf离心管中，而后加入 0.5 μL （10 U/μL）内切酶，2 μL Buffer，7.5 μL双蒸水，于37℃消化过夜。酶切产物用3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测。

1.6 群体多态性分析 遗传纯合度（homozygosity，Ho）与杂合度（heterozygosity，He）以及多态信息含量（polymorphism information content，PIC）等指标的计算参照文献方法［1］。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果 对提取的DNA进行电泳检测，其结果见图1。由图1可见，提取DNA目的条带清晰，无杂带，可用于后续试验分析。

2.2 PCR扩增结果 对PCR产物进行电泳检测，其结果见图2。由图2可见，扩增片段的特异性好，大小约为200 bp，表明PCR扩增获得了目的片段。

2.3 脂联素基因PCR-RFLP分析 经MvaⅠ内切酶对PCR产物进行单酶切的结果表明（见图3），所检测的67个个体中，有3种基因型个体，分别记为 AA 型（204 bp）、AB 型（204 bp+156 bp+48 bp）和BB型（156 bp+48 bp）。脂联素基因第2外显子MvaⅠ-RFLP的基因频率与等位基因频率的分布情况见表1。

图3 脂联素基因MvaI-RFLP

2.4 脂联素突变位点的群体遗传学特性 对酶切产物的群体遗传学指标分析结果（见表2）表明，群体PIC＜0.25，脂联素基因在该位点属于低度多态；P＞0.05表明整个群体在该位点处于平衡状态。

3 讨论

武定鸡是我国著名的地方优良鸡种，以肥育性能好、肉质鲜嫩等特性而闻名于世。而有关武定鸡脂联素基因的单核苷酸多态性及对生产、繁殖性能效应的研究尚未见报道。该试验中武定鸡脂联素基因在酶切位点（NC_006096）第2外显子上的c.C565G突变位点PIC＜0.25，脂联素基因在该位点属于低度多态；P＞0.05表明整个群体在该位点处于平衡状态，而黄煌［1］在固始鸡与安卡鸡F2资源群体中该位点属于中度多态位点且群体处于极不平衡状态（P＜0.01）。该研究中的酶切结果显示该位点有3种基因型，BB型只检测到1只，这可能是长期的选择造成的结果，也可能是B基因在该群体中分布较少，分析的样本量不够所导致。

［1］黄煌.鸡脂联素基因多态性及其与经济性状的相关性研究［D］.郑州：河南农业大学，2010.

［2］薛攀，华燕艳，崔小川.脂联素与肺癌合并COPD患者肺功能、年龄、性别的相关性分析［J］.实用癌症杂志，2016，31（2）：258-260.

［3］宋薇，陈爱荣.脂联素与恶性肿瘤相关性研究进展［J］.甘肃医药，2016（3）：178-181.

［4］李晶，程文俊，马宇虹.脂联素在心血管疾病中的研究进展［J］.中国医药导报，2016（9）：76-79.

［5］杨彦杰，昝林森，王洪宝.秦川牛脂联素基因SNPs检测及其与胴体、 肉质性状的相关性 ［J］.遗传，2009，31（10）：1006-1012.

［6］吴芸.猪脂联素基因遗传多态性及其与肉质性状的相关性研究［D］.贵阳：贵州大学，2008.

［7］董飚，龚道清，孟和，等.鸭脂联素基因单核苷酸多态性检测及群体遗传分析［J］.遗传，2007，29（8）：995-1000.

［8］刘大林，俞亚波，魏岳，等.脂联素基因对京海黄鸡体重及屠体性状的遗传效应［J］.扬州大学学报（农业与生命科学版），2009，30（1）：31-34.

［9］李生，王洪超，丛立新.AA肉鸡脂联素基因表达与皮下脂肪和腹腔内脂肪含量的关系 ［J］.饲料研究，2015（19）：1-3.

PCR-RFLP Analysis on Adiponectin Gene of Wuding Chicken

DING Xiang-hong，WU Pei-fu，ZHOU Jie-long，CHEN Fen-fen
（College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

The polymorphism of c.C565G mutation site in second exon of adiponectin gene （NC_006096） from 67 Wuding Chicken was assessed by PCR-RFLP.Single enzyme digestion of the PCR products was performed with restriction enzyme of MvaⅠ.The results revealed that 3 genetypes（AA,AB and BB）were found in the locus.The population genetics characteristics were analyzed by Chi-square （χ2） fitness test and the results demonstrated that the locus of c.C565G was under equilibrium condition.

Wuding Chicken；adiponectin gene；PCR-RFLP

S831.2；Q51

A文章顺序编号：1672-5190（2016）08-0025-02

2016-07-05

项目来源：云南省教育厅科学研究基金项目（2012Y230）；云南省特色优势重点学科生物学一级学科建设项目（50097505）。

丁相红（1993—），男，所学专业为动物科学。

陈粉粉（1976—），女，高级实验师，硕士，主要研究方向为生物技术与家畜育种。

（责任编辑：慕宗杰）