混菌固态发酵棉粕工艺参数的优化

刘惠琴,田永强,*,徐　力,张阿强,陈锡明

(1.兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070;2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃兰州 730000)



混菌固态发酵棉粕工艺参数的优化

刘惠琴1,田永强1,*,徐力1,张阿强1,陈锡明2

(1.兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070;2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃兰州 730000)

利用产朊假丝酵母和从棉籽壳上分离得到的细菌M2对棉粕进行混合固态发酵。通过分子生物学鉴定M2为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),在NCBI中获得登录号为KT962208。通过采用DPS v7.05统计软件中的二因子有重复观察值实验和均匀优化实验分别对固态发酵的接种量和接种及发酵温度、时间和初始含水量进行优化,并对实验数据进行分析。结论:得出混菌固态发酵棉粕的最佳接种量为4 mL/100 g,产朊假丝酵母与M2的接种比为7∶3,发酵温度32.5 ℃,发酵时间54 h,底物初始含水量75%。此条件下游离棉酚的降解率为53.021%,粗蛋白含量为45.889%,且蛋白分子量有所减小。

混菌,固态发酵,棉粕,游离棉酚

棉粕是棉花加工业的主要副产品,其粗蛋白含量在36%～45%之间,含有维生素和矿物质元素等多种营养物质,是一种较好的植物源蛋白饲料资源[1-4]。棉粕中的游离酚对动物机体有毒害作用,还有抗营养因子植酸、单宁、环丙烯脂肪酸等,限制了它在畜牧养殖业中的应用[5]。因此,对棉粕进行脱毒处理,成为开发其利用价值的一项重要研究。微生物发酵是降低棉酚含量的有效方法之一[6]。

利用微生物发酵棉粕脱毒的方法可以不同程度消除游离棉酚对动物体的毒害作用,若用能降解游离棉酚的益生菌发酵,还可以改善动物体的肠道微生态环境,促进动物对营养物质的吸收等。武汉工业学院的王小磊[7]等人对黑曲霉、米曲霉与酿酒酵母混合固态发酵对棉粕脱毒的发酵条件的研究,发酵后棉粕中游离棉酚的降解率达到96.2%;Xiao-Yan Weng[8]等人通过利用热带假丝酵母ZAU-1(Candida tropicalis ZAU-1)发酵棉粕,游离棉酚的降解率达到94.12%。研究表明还可以利用棉粕作辅料来生产单细胞蛋白,如Anupama[9]等人利用玉米粉等来研究黑曲霉(Aspergillus niger)单细胞蛋白的生成条件。本研究采用冯莉[10]对接种量和接种比及发酵参数优化所采用的实验设计方法,对产朊假丝酵母和M2混合发酵棉粕的工艺参数进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

棉粕、麸皮、玉米粉市场。

产朊假丝酵母(31272)中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC);M2从实验室提供的棉籽壳中分离获得。

正己烷利安隆博华(天津)医药化学有限公司;异丙醇天津市凯信化学工业有限公司;3-氨基-1-丙醇上海麦克林生化科技有限公司;冰乙酸利安隆博华(天津)医药化学有限公司;苯胺上海中泰化学试剂有限公司;实验室所用试剂均为分析纯。

SW-CJ-1B型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司;LDZX-50FA型高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;HNY-1102C恒温培养振荡器天津市欧诺仪器仪表有限公司;722s型可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;JSP-100型多功能高速粉碎机浙江省永康市金穗机械制造厂;KDN-08A凯氏定氮仪上海昕瑞仪器仪表有限公司。

1.2实验方法

1.2.1培养基的制备初筛培养基:醋酸棉酚无糖查氏培养基,硫酸铵0.5%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、硫酸镁0.05%、氯化钙0.1%、酵母膏0.02%、醋酸棉酚0.2%(用丙酮溶解),自然pH,固体培养基加琼脂1.8%～2%,在121 ℃下,灭菌20 min。

复筛及固态发酵培养基:棉粕+玉米粉+麸皮=6∶2∶2,按比例称取共30 g,置于480 mL组培瓶中,自然pH,在121 ℃下,灭菌20 min,然后按70%初始含水量将定量的无菌水加入组培瓶中,搅拌均匀,备用。

LB培养基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%,自然pH,固体培养基加琼脂1.8%～2%,在121 ℃下,灭菌20 min。

YPD培养基:葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%,自然pH,固体培养基加琼脂1.8%～2%,在121 ℃下,灭菌20 min。

1.2.2菌种筛选称取1 g棉籽壳,加入装有50 mL液体醋酸棉酚无糖查氏培养基的三角瓶中,30 ℃下,150 r/min培养24 h后,梯度稀释,然后分别吸取200 μL稀释液,均匀涂布在醋酸棉酚无糖查氏培养基平板上,28 ℃下培养,待长出单菌落后,挑去单菌落纯化。将纯化后的菌株接于种子液中,待生长至对数期,以干物质质量的8%接种于固态发酵进行复筛。

1.2.3菌株鉴定对复筛得到的菌株进行分子生物学鉴定,即提取复筛所得菌株的16S rDNA,送至测序公司进行测序。

1.2.4复合固态发酵将酵母菌活化在YPD固体培养基上,28 ℃下培养48 h后,用接种环挑去3环接种于50 mL YPD液体培养基中,30 ℃、150 r/min培养20 h,备用。

将复筛所得菌株(M2)活化,接种于种子液培养基,生长至对数期,备用。

复合发酵接种量和接种比的优化采用DPS v7.05统计软件中的二因子有重复观察值的设计方法,如表1所示,接种量和接种比分别以4水平和5水平设计,实验共设20个处理组,每个处理组3个重复。测定指标为发酵产物中游离棉酚的降解率。

表1　产朊假丝酵母和M2接种量和接种比优化的因子与水平

复合发酵工艺参数包括发酵温度、时间、初始含水量3个因素,实验采用DPS v7.05统计软件设计3因素4水平的均匀设计实验法优化发酵参数,如表2所示。复合固体发酵条件参数的优化设计方案如表3所示,实验共设4个处理组,每个处理组3个重复。测定指标为发酵产物中游离棉酚的降解率。

表2　复合固态发酵工艺参数的因子水平

表3　复合固态发酵工艺参数的优化均匀设计方案

1.2.5指标测定方法游离棉酚的降解率:

游离棉酚的测定:采用国标标准GB13086-91,饲料中游离棉酚的测定方法。

粗蛋白含量的测定:参照GB/T 6432-94,饲料中粗蛋白测定方法。

蛋白质分子量的测定:SDS-PAGE[11]。

2　结果与分析

2.1菌株筛选

实验初筛得到3株能在醋酸棉酚无糖查氏培养基上生长的菌,两株细菌M1和M2,一株丝状真菌M3,然后以8%的接种量接入固态发酵底物中,细菌发酵48 h,真菌发酵60 h后,经测定所得结果如图1所示。

图1　初筛菌株固态发酵对游离棉酚的降解率 Fig.1　The degradation rate of free gossypol by screening strains solid state fermentation

由图1可以得出,初筛所得的3株菌对游离棉酚的降解能力不同,由强到弱依次是:M2>M1>M3,对游离棉酚的降解率分别是36.599%、33.132%、14.297%。3株菌中M2对游离棉酚的降解率最大,因此,对M2进行分子鉴定,并与产朊假丝酵母对棉粕复合固态发酵。

表4　二因子有重复观察值实验结果

注:同行同项数据肩标大写字母不同表示差异极显著(p<0.01),小写字母完全不同表示差异显著(p<0.05),含有相同字母表示差异不显著(p>0.05)。2.2菌株鉴定

对复筛所得对游离棉酚降解能力较强的菌株M2进行分子生物学鉴定,提取M2的DNA,并用通用引物扩增:上游引物为5′-GAGCGGATAACAA TTTCACACAGG-3′,下游引物为5′-CGCCAGGGTTTT CCCAGTCACGAC-3′,PCR扩增产物电泳结果如图2所示,扩增后送至测序公司进行测序。通过BLAST将M2的扩增序列进行比对,得出菌株M2与产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)相似性为99%。将M2的扩增序列提交至GenBank,获得登录号为KT962208。

图2　PCR电泳图Fig.2　Electrophoresis map of PCR 注:M为Mark;1为空白对照;M2为目的片段。

2.3复合发酵接种量和接种比的优化

适宜的接种量对固态发酵培养基中菌体的生长影响较大,适宜的接种量不仅可以缩短菌株生长的延滞期,以减少发酵时间,而且还可使菌体迅速生长、繁殖,占据整个培养的环境,以减少杂菌的污染。通过DPS v7.05对表4中的实验数据进行统计处理,得到表5所示的不同接种量与接种比对棉粕发酵底物中游离棉酚降解率的影响。

表5　不同接种量与接种比例对棉粕发酵底物中游离棉酚降解率的影响

注:同行同项数据肩标大写字母不同表示差异极显著(p<0.01),小写字母完全不同表示差异显著(p<0.05),含有相同字母表示差异不显著。由表5可得,当接种量为4、6、8 mL/100 g时,随着接种量的增加,降解率逐渐降低,接种量为4 mL/100 g时,降解率最大,为42.628%,且差异极显著(p<0.01);当接种量为10 mL/100 g时,降解率为41.385%,且差异不显著,其原因可能是发酵底物没有搅拌均匀。随着接种比的变化,降解率先升高后降低,产朊假丝酵母与M2的比例为7∶3时,降解率最大,为43.355%,差异极显著(p<0.01)。因此,两种菌的最佳组合为A1B4,即接种量为4 mL/100 g,接种比为7∶3。

通过表5还可得出,接种量、接种比及其互作对游离棉酚降解率的影响都极显著(p<0.01),其主次效应顺序为接种量(A)、互作效应(A×B)、接种比(B)。

2.4复合发酵工艺参数的优化

采用DPS v7.05统计软件,以游离棉酚的降解率作为目标函数Y,对表6的实验数据进行逐步回归分析,得到线性回归方程:Y=26.50-0.76X1+0.48X3,X2与游离棉酚的降解率回归关系非常小,因而在回归方程中被剔除。经统计分析,该方程的决定系数R2=0.9964,表明该回归方程与实验结果符合度极好。温度(X1/ ℃)、初始含水量(X3/%)与Y的偏相关系数分别为-0.9904、0.9978,经检验,X3对游离棉酚的降解率有极显著的影响(p<0.01),而X1对游离棉酚的降解率有显著的影响(p<0.05)。由回归方程可得,游离棉酚的降解率与X1呈负相关,与X3呈正相关,因此最佳的发酵条件为温度32.5 ℃,发酵时间为54 h,底物初始含水量为75%。

表6　固态发酵工艺参数的优化实验结果

2.5发酵物中粗蛋白含量及蛋白分子量的变化

由表7可知,当接种量为4 mL/100 g,产朊假丝酵母与M2的接种比为7∶3,发酵温度32.5 ℃,发酵时间54 h,底物初始含水量75%时,游离棉酚的降解率为53.021%,与上述实验结果相符。发酵后底物中粗蛋白含量为45.889%,与发酵前相比,升高了2.037%,其原因可能是产朊假丝酵母的菌体蛋白。由图3可知,发酵后的蛋白分子量与发酵前相比相对较小,大分子蛋白在一定程度上有所减少。

表7　验证实验结果

图3　SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis注:1.Mark;2.对照组;3,4,5.实验组。

3　结论

首先,从棉籽壳中分离出一株能降解游离棉酚的细菌M2,并鉴定为为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),让其与产朊假丝酵母复合固态发酵棉粕,得出这两株菌复合发酵对游离棉酚的降解率与它们分别发酵时的降解率高,这说明这两株菌之间没有拮抗作用,可能存在互利共生的作用。通过实验优化,得到其最佳发酵工艺参数为接种量为4 mL/100 g,产朊假丝酵母与M2的接种比为7∶3,发酵温度32.5 ℃,发酵时间54 h,底物初始含水量75%,pH自然。在此条件下游离棉酚的降解率最高,达到53.021%。

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[3]Xin Wang,Jiang-wu Tang,Xiao-hong Yao,et al. Effect of Bacillus cereus on bacterial community and gossypol content during fermentation in cottonseed meal[J]. African Journal ofMicrobiology Research,2012,6(36):6537-6544。

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Optimization of the process parameters of cottonseed cake by solid-state fermentation with mixed culture

LIU Hui-qin1,TIAN Yong-qiang1,*,XU Li1,ZHANG A-qiang1,CHEN Xi-ming2

(1.Lan Zhou Jiao Tong University,Chemical and Biological Engineering College,Lanzhou 730070,China; 2.Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By using Candida utilis and bacteria M2 that was isolated from cottonseed shell to be solid-state fermentated cottonseed meal. Molecular identification showed that M2 was Klebsiella oxytoca and the login number was KT962208 in the NCBI. By using the two factors have repeated observation value test and uniform design test of DPS v7.05 statistical software to respectively optimize inoculum and inoculation ratio,and the fermentation temperature,time and initial containing water of solid state fermentation.And analyzed these experimental data. Finally,come to the conclusion that the best inoculation amount was 4 mL/100 g and the inoculation ratio of Candida utilis yeast and M2 was 7∶3,the fermentation temperature was 32.5 ℃,time was 54 h,initial containing water was 75%. Under this kind of condition,the degradation rate of gossypol was 53.021%,the crude protein content was 45.889%,and the molecular weight of the protein has slightly decreased.

mixed bacteria;solid state fermentation;cottonseed meal;free gossypol

2016-01-14

刘惠琴(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：工业微生物发酵，E-mail：huiqin4625@163.com。

田永强(1972-)，男，博士，教授，从事微生物分离、鉴定和应用研究，E-mail：357181873 @qq.com。

甘肃省科技支撑计划项目(613035)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)17-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.033