野葛块根异黄酮的提取及抗氧化研究

李　玲，谭　力，全沁果，全　浩，何福林，黄光文，邵金华，闫旭宇，*

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院，湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425199；2.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058；3.中国农业科学院 农产品加工研究所，农业部农产品加工质量安全风险评估实验室，北京 100193)



野葛块根异黄酮的提取及抗氧化研究

李玲1，2，谭力1，全沁果3，全浩1，何福林1，黄光文1，邵金华1，闫旭宇1，*

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院，湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425199；2.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058；3.中国农业科学院 农产品加工研究所，农业部农产品加工质量安全风险评估实验室，北京 100193)

以土家山区野葛块根为试验材料，采用超声波辅助乙醇提取野葛块根异黄酮。在单因素试验的基础上，以提取率为响应值，运用4因素4水平响应面分析法研究提取过程中工艺参数对提取率的影响，并对异黄酮提取物的抗氧化性能进行了研究。结果表明：最适提取工艺条件为乙醇浓度81.0%，超声时间41.2 min，提取温度61.2℃，料液比(m/V)1∶9.5，原料粒径40目。在此工艺条件下，野葛块根异黄酮的平均提取率为3.43%。所提取的野葛块根异黄酮的抗氧化效果低于Vc，但能与其产生一定的协同作用。

野葛；异黄酮；抗氧化

野葛为豆科葛属多年生落叶草质藤本植物，药用价值较高，是一种重要的野生植物资源。野葛的适应性很强，广泛分布在我国除西藏、新疆以外的地区，尤其是湖南地区的温暖湿润环境，可促使野葛快速蔓生，是张家界市土家族聚居区的名贵特产之一[1]。研究发现，野葛葛根中异黄酮种类丰富，有葛根素、大豆甙元、金雀花异黄素、大豆甙等30多种异黄酮成分，其中葛根素是葛根的特有成分和主要有效成分，约占野葛总异黄酮含量的50%。葛根异黄酮具有防治和改善心脑血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、解酒护肝、调节内分泌系统等多种药理作用，其药理活性强，药效明确，临床应用广泛，具有良好的发展前景[2-8]。目前，野葛中异黄酮的提取方法主要有加热回流法、超声波辅助提取法、微波辅助萃取法等。与传统加热回流和水解相比，超声提取与微波提取法具有省时节能、提取率高等优点，可降低提取温度、缩短提取时间，有利于葛根素提取的产业化发展[9-12]。关于野葛异黄酮含量的确定，一般采用葛根素或大豆苷元为标准品。结合实际，本试验采用超声波辅助提取法，用土家野生葛根块根为原料，以乙醇为提取剂来提取野葛块根异黄酮，以葛根素为标准品，制作标准曲线来测定所提取野葛块根异黄酮的含量，并研究了野葛块根异黄酮对DPPH自由基的清除作用，初步探索其抗氧化性能，为综合开发利用野葛块根提供一定的数据积累。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料与试剂

新鲜野葛块根，于2014年9月采自湖南张家界山区(土家族聚居区)；葛根素标准品，上海源叶生物科技有限公司；DPPH为分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

1.1.2仪器与设备

UV-2800型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SHIMADZU型分析天平，日本岛津公司；WG-71电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；FZ-102植物粉碎机，上海胜启仪器仪表有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；K201D-Ⅱ旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长盛实验仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1提取工艺流程

野葛块根→切块→烘干→粉碎→乙醇提取→过滤→提取液。

1.2.2葛根素标准曲线绘制

以葛根素为标准品，将配制好的不同浓度的标准溶液在250 nm下进行比色测定，以吸光度(D)为纵坐标，葛根素质量浓度c(mg·mL-1)为横坐标，做标准曲线，得葛根素标准曲线回归方程为D=0.0268c+0.0662，R2=0.999 0。

1.2.3野葛块根异黄酮提取率的计算

野葛块根异黄酮的提取率计算公式为：

(1)

式(1)中：W为野葛块根异黄酮的提取率；D为吸光度值；Q为稀释的总倍数；V为过滤液总体积(mL)；m为所称量的试验材料质量(mg)。

1.3单因素实验设计

通过单因素实验，研究乙醇浓度、提取温度、超声时间、料液比和原料粒径对野葛块根异黄酮提取率的影响，确定超声辅助提取异黄酮的最适工艺参数范围。

1.3.1乙醇浓度对野葛块根异黄酮提取率的影响

准确称取干燥的野葛块根粉末2.0 g，分别用40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液浸泡30 min后，在料液比1∶10，温度50℃，超声时间20 min条件下，研究乙醇浓度对野葛块根异黄酮提取率的影响。

1.3.2提取温度对野葛块根异黄酮提取率的影响

准确称取干燥的野葛块根粉末2.0 g，用最适乙醇浓度溶液浸泡30 min 后，在料液比1∶10，超声时间20 min的条件下，分别在30，40，50，60，70℃提取，研究提取温度对野葛块根异黄酮提取率的影响。

1.3.3超声时间对野葛块根异黄酮提取率的影响

准确称取干燥的野葛块根粉末2.0 g，用最适乙醇浓度溶液浸泡30 min后，在最适提取温度，料液比1∶10条件下，分别设定辅助提取时间为10，20，30，40，50 min，研究超声时间对野葛块根异黄酮提取率的影响。

1.3.4料液比对野葛块根异黄酮提取率的影响

准确称取干燥的野葛块根粉末2.0 g，用最适乙醇浓度溶液浸泡30 min后，在最适提取温度和最适超声时间下，分别设定料液比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，研究料液比对野葛块根异黄酮提取率的影响。

1.3.5原料粒径对野葛块根异黄酮提取率的影响

准确称取干燥的野葛块根粉末2.0 g，固定其他条件为最适条件，设置原料粒径分别为20，40，60，80，100目，研究原料粒径对野葛块根异黄酮提取率的影响。

1.4响应面实验设计

在单因素实验的基础上，以异黄酮提取率为响应值，选取单因素实验中对野葛块根异黄酮提取率影响较显著的因素进行4因素4水平响应面试验，确定超声波辅助提取野葛块根异黄酮的最适工艺参数。

1.5抗氧化性实验设计

用分析天平准确称取DPPH标准品10 mg，以95%乙醇溶液定容至100mL，得到10%的DPPH溶液。用移液管准确移取该溶液3mL，分别加入不同浓度的样液各1mL，充分摇匀，置于室温阴暗处静置30 min，在波长517 nm处测定吸光度(Di)。同时测定1mL溶剂与3mLDPPH溶液混合后的吸光度(Dc)，以及1mL样液与3mL95%乙醇溶液混合后的吸光度(Dj)。根据公式计算出抑制率。抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，说明抗氧化性越强，其计算公式为：

清除率(%)=[1-(Di-Dj)/Dc]×100

2　结果与分析

2.1野葛块根异黄酮提取条件的优化实验结果

2.1.1乙醇浓度对野葛块根异黄酮提取率的影响

在提取温度为50℃，料液比1∶10，超声时间为20 min的条件下，由图1可知，随着乙醇浓度的增大，野葛块根异黄酮的提取率逐渐增加，当乙醇浓度为80%时，提取率最高，之后下降。因此，乙醇浓度以80%为宜。

图1　乙醇浓度对野葛块根异黄酮提取率的影响Fig.1　Effects of ethanol concentrations on isoflavone extraction rate

2.1.2提取温度对野葛块根异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为80%，料液比1∶10，超声时间20 min的条件下，由图2可知，当超声温度为60℃时，野葛块根异黄酮的提取率达到最大。因此，超声波辅助提取的温度宜控制在60℃。

图2　提取温度对野葛块根异黄酮提取率的影响Fig.2　Effects of extraction temperature on isoflavone extraction rate

2.1.3超声时间对野葛块根异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为80%，料液比1∶10，提取温度60℃条件下，由图3可知，野葛块根异黄酮的提取率随着超声时间的增加而增加，当提取时间延长至40 min时，提取率最高，而后有所降低。因此，超声时间宜控制在40 min。

2.1.4料液比对野葛块根异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为80%，超声时间40 min，提取温度为60℃条件下，由图4可知，当料液比为1∶10时，野葛块根中异黄酮的提取率最高，当液体比例进一步增大后，提取率明显降低。因此，料液比以1∶10为最适条件。

图3　超声时间对野葛块根异黄酮提取率的影响Fig.3　Effects of ultrasound-assisted extraction time on isoflavone extraction rate

图4　料液比对野葛块根异黄酮提取率的影响Fig.4　Effects of solid to liquid ratio on isoflavone extraction rate

2.1.5原料粒径对野葛块根异黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为80%，超声时间40 min，提取温度为60℃，料液比1∶10的条件下，由图5可知，当粒径达40目以后，异黄酮提取率已趋于平稳。因此，从经济方面考虑，以40目粒径为最适条件。

图5　原料粒径对野葛块根异黄酮提取率的影响Fig.5　Effects of particle size on isoflavone extraction rate

2.2响应面试验结果

根据单因素试验结果，原料粒径的变化对试验结果影响较小，故确定乙醇浓度、提取温度、超声时间和料液比为响应面实验因素，固定原料粒径为40目，以提取率为响应值，设计响应面试验，试验方案及结果见表1。

表1响应面试验方案及实验结果

Table 1Design scheme and results of response surface test

试验号乙醇浓度/%提取温度/℃超声时间/min料液比/(g·mL-1)异黄酮提取率/%提取率预测值/%17550401∶102.392.5328550401∶102.482.6337570401∶102.622.6648570401∶102.882.9258060351∶52.432.5668060451∶52.692.8078060351∶152.272.3588060451∶152.492.5597560401∶52.512.53108560401∶52.762.75117560401∶152.342.34128560401∶152.502.48138050351∶102.562.51148070351∶102.712.71158050451∶102.732.72168070451∶102.902.94177560351∶102.822.73188560351∶102.972.90197560451∶103.042.93208560451∶103.233.14218050401∶52.482.33228070401∶52.642.55238050401∶152.202.11248070401∶152.342.31258060401∶103.383.42268060401∶103.493.42278060401∶103.463.42288060401∶103.403.42298060401∶103.363.42

采用Design Expert 8.0.5b软件对表1中试验结果进行多项拟合回归，得到异黄酮提取率(Y)对乙醇浓度(A)、提取温度(B)、超声时间(C)和料液比(D)的二次多项回归模型方程：Y=-96.59533+1.66060A+0.49972B+0.71813C+0.57270D+0.00085AB+0.00040AC-0.00090AD+0.00010BC-0.00010BD-0.00040CD-0.010627A2-0.004692B2-0.009127C2-0.025077D2。

为了检验回归方程的有效性，进一步确定各因素对野葛块根异黄酮提取率的影响程度，对回归模型进行方差分析，结果见表2。模型的F=22.90，极显著；失拟项的P值为 0.060 1，不显著，说明数据没有异常点；决定系数R2=0.958 2，说明响应值的变化中有95.82%来源于所选因素，表明模型拟合度好，回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系，方法可靠。

回归模型中一次项A达到显著水平，而B，C，D均达到极显著水平；二次项中4个因素的P值均小于0.01，说明试验中4个因素的二次项都具有极显著影响，表明实验因素与响应值不是简单的线性关系；但4个因素两两交互项不显著。考查P值与F值大小，可得各因素对野葛块根异黄酮提取率的影响，依次为料液比(D)>超声时间(C)>提取温度(B)>乙醇浓度(A)。

用Design Expert 8.0.5b软件对二次多项式回归方程进行计算，确定最适的提取条件为：乙醇浓度80.95%、提取温度61.22℃、超声时间41.24 min、料液比1∶9.52，在原料粒径为40目下，预测提取率为3.452%。考虑到实际操作的局限性，提取工艺最终修正为：乙醇浓度81.0%、提取温度61.2℃、超声时间41.2 min、料液比(m/V)1∶9.5(g·mL-1)、原料粒径为40目。此条件下进行试验验证，设置4个试验组，每组平行测定3次，如表3所示，野葛块根异黄酮实际提取率为3.43%，与预测值接近。

表2响应面回归模型方差分析

Table 2ANOVA results of the constructed response surface regression

方差来源平方和自由度均方FP显著性模型3.98140.2822.90<0.0001**A0.1010.108.130.0128*B0.1310.1310.490.0059**C0.1510.1511.700.0041**D0.1610.1612.600.0032**AB0.00722510.0072250.580.4581AC0.00040010.0004000.0320.8601AD0.00202510.0020250.160.6924BC0.00010010.0001000.0080580.9297BD0.00010010.0001000.0080580.9297CD0.00040010.0004000.0320.8601A20.4610.4636.89<0.0001**B21.4111.41113.95<0.0001**C20.3410.3427.210.0001**D22.5512.55205.43<0.0001**残差0.17140.012失拟项0.16100.0165.350.0601纯误差0.01240.00302总和4.1528R20.9582

注：**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)。

对常规浸提方法与超声辅助浸提工艺进行比较，即在最适工艺的基础上取消超声辅助处理步骤。同样设置4个处理组，每组重复3次。由表3可知，常规方法下野葛块根异黄酮提取率平均仅为2.53%，超声波辅助浸提法提取效率较常规方法具有明显优势。

表3常规方法与优化方法的野葛块根异黄酮提取率

Table 3The extraction rate of isoflavones by regular or optimized extraction method

试验组提取率/%常规方法超声辅助浸提12.52±0.063.42±0.0622.50±0.093.45±0.0432.55±0.033.41±0.0742.52±0.063.42±0.04平均值2.53±0.063.43±0.05

注：表中数据代表平均值±标准差，下同。

2.3野葛块根异黄酮对DPPH自由基的清除作用

为了确定野葛块根异黄酮的抗氧化能力，测定了其对DPPH自由基的清除作用，结果见图6。随着野葛块根异黄酮和Vc浓度的增加，二者对自由基的清除率均逐渐增加，当浓度大于0.6 mg·mL-1时，二者对自由基的清除率增速均渐趋平缓；将异黄酮和Vc按1∶1体积混合后，其对DPPH的清除效果强于异黄酮提取物单体。总体而言，野葛块根异黄酮对羟基自由基的清除率低于Vc，但能与Vc产生一定的协同效应。

图6　野葛块根异黄酮和Vc对自由基的清除效果Fig.6　The radical-scavenging effect of Vc and extracted isoflavone

3　讨论

黄酮类化合物一般易溶于水、乙醇等极性强的溶剂中，难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中，且乙醇对细胞膜的破坏作用比水强，使得黄酮类化合物更易溶出，故本研究选择乙醇作为提取溶剂[13]。通过对加热回流法、微波辅助萃取法、超声波辅助提取法、常规浸提法等提取异黄酮的方法进行比较，发现超声波辅助提取法能加快野葛细胞破碎的速度、降低能耗、节省时间，且提取的产品纯度较高[14]，因此，本试验选择超声波辅助乙醇提取法提取野葛块根中的异黄酮。

单因素及响应面试验结果表明，超声波辅助乙醇法提取野葛块根异黄酮时，各因素对异黄酮提取效果的影响依次为料液比>超声时间>提取温度>乙醇浓度。最适提取条件为：乙醇浓度81.0%，超声时间41.2 min，提取温度61.2℃，料液比1∶9.5，原料粒径为40目；在此条件下，异黄酮的提取率为3.43%，较常规浸提法的提取率高出近1个百分点，极大地提高了野葛块根异黄酮的生产效率，且节约能耗，在实际生产中具有较好的应用前景。

DPPH自由基是一种非常稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm处有一强吸收峰，黄酮类化合物的电子可与其孤对电子配对，使其在517 nm处吸光度变小，吸光值的变化即可反映样品对自由基的清除能力[15]。在本研究中，随着野葛块根异黄酮浓度的增加，其对自由基的清除率也逐渐增加，但略低于Vc，说明野葛块根异黄酮具有一定的抗氧化活性。

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(责任编辑高峻)

Extraction and antioxidant effects of isoflavone in Pueraria lobata (Willd.) Ohwi root tuber

LI Ling1，2，TAN Li1，QUAN Qin-guo3，QUAN Hao1，HE Fu-lin1，HUANG Guang-wen1，SHAO Jin-hua1，YAN Xu-yu1，*

(1.Department of Chemistry and Biological Engineering，Hunan University of Science and Engineering，Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South，Yongzhou 425199，China;2.College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;3.Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Laboratory of Agro-products Quality Safety Risk Assessment，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China)

In the present study，isoflavone was extracted from Pueraria lobata(Willd.) Ohwi root tuber collected in Tujia Mountain by ultrasound-assisted ethanol extraction.Based on single factor test analysis，main technology parameters of the extraction process were optimized by response surface design of 4 factors and 4 levels，and antioxidant effects of the extracted isoflavone were also studied.The results showed that the optimum extraction technology was as follows:the ethanol concentration was 81.0%，ultrasound-assisted extraction time was 41.2 min，extraction temperature was 61.2℃，solid to liquid ratio (m/V) was 1∶9.5，and particle size of raw material was 40 mesh.Under this condition，the extraction rate of isoflavone reached 3.43%.The antioxidant effects of the extracted isoflavone were weaker than that of vitamin C，but it could yield synergetic effect with vitamin C.

Pueraria lobata(Willd.) Ohwi;isoflavone;antioxidants

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):496-501http://www.zjnyxb.cn

李玲，谭力，全沁果，等.野葛块根异黄酮的提取及抗氧化研究[J].浙江农业学报，2016，28(3)： 496-501.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.22

2015-08-10

中国博士后科学基金面上项目(2014M561768)；湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室开放基金(XNZW14C12)；湖南省永州市2015年度指导性科技计划项目(2015-10)；永州市科技创新项目(永财企指2015[25]号-9)

李玲(1982—)，女，山西长治人，博士，副教授，研究方向为植物生物技术。E-mail:liling7826@126.com

，闫旭宇，E-mail:yanxuyu1979@163.com

S58；TQ464

A

1004-1524(2016)03-0496-06