注射填充β-磷酸三钙生物陶瓷透明质酸混悬液的实验研究

刘庆阳，卢建熙，周智华，郭新雯，潘舒亚，李　平，姚宸维（.上海仁爱医院美容外科 上海 005；.上海贝奥路生物材料有限公司 上海 04；.上海市第一人民医院 上海 00080）

·基础研究·

注射填充β-磷酸三钙生物陶瓷透明质酸混悬液的实验研究

刘庆阳1，卢建熙2，周智华3，郭新雯1，潘舒亚1，李平1，姚宸维2
（1.上海仁爱医院美容外科 上海 200235；2.上海贝奥路生物材料有限公司 上海 201114；3.上海市第一人民医院 上海 200080）

目的：通过β-磷酸三钙生物陶瓷与透明质酸混合后形成稳定的混悬液进行注射填充，初步了解其在兔体内的组织反应、有无刺激增生及其诱导骨生成的可能性。方法：按预先设计制成2 种不同比例的混悬液（β-磷酸三钙生物陶瓷与透明质酸的比例分别为3∶17、3∶12），分别标记为A、B，对照组为生理盐水。12只新西兰大白兔随机分成3组，在三组白兔背部上下区域进行注射，按组别随机注射。注射后分别于第2、4、12 周提取标本，行相应观察。结果：混悬液注射区未见明显排异反应，皮肤无红肿，无渗出，对照组未见明显异常反应，1～12 周的β-磷酸三钙生物陶瓷与周围组织结合逐渐紧密，周围组织细胞形态典型，细胞分布致密，未见明显异常。材料周围未见明显的纤维包膜形成，未见骨形态发生蛋白2（BMP2）阳性反应。结论：β-磷酸三钙生物陶瓷透明质酸混悬液有良好的组织相容性，无刺激性，吸收慢、不会在软组织出现成骨现象，可通过注射方式进行填充治疗，有望成为一种新型的注射性填充剂应用于整形美容领域。

β-磷酸三钙生物陶瓷；透明质酸；注射；组织填充剂；骨形态发生蛋白2

β-磷酸三钙生物陶瓷是一种骨填充材料，主要应用在骨科、口腔、整形等领域。研究表明，β-磷酸三钙具有良好的生物相容性，无细胞毒性和排斥反应，有良好的诱导成骨能力，持续时间长，并能够在体内获得完全降解［1-3］。目前其多用于手术时进行填塞植骨，无法通过微创方法注入体内达到填充效果。透明质酸作为软组织填充剂已经应用于临床，效果良好，但其持续时间短，一直是影响其临床疗效的主要因素［4-6］。能否将两种材料混合一起，形成可注射的混悬液进行注射填充，利用β-磷酸三钙的长代谢时间来达到相对时间较长的填充效果，目前还没有见到相关报道。另观察β-磷酸三钙的诱导成骨情况，可能为以后临床骨性结构的缺损，凹陷甚至发育不足（如小颏畸形）导致的畸形通过注射方法达到骨性修补提供可能帮助。

1　材料和方法

1.1实验材料：β-磷酸三钙生物陶瓷购自上海贝奥路生物材料有限公司，粒径为300～500μm，纯度为95%，透明质酸购自山东华熙生物科技有限公司，浓度为17mg/ml；以上两种产品均为无菌包装，在无菌操作下将β-磷酸三钙生物陶瓷与透明质酸按照2种不同的比例（3∶17、3∶12）混合，并在振荡器上混匀形成混悬液，分别标记为A、B，另有一组无菌生理盐水C。

1.2方法：新西兰大白兔18只（常州卡文斯），平均体重约4.5kg。随机分成3组，每组6只，3%戊巴比妥钠1ml/kg兔耳缘静脉注射麻醉，背部剃毛，消毒铺巾［7］。三组兔背部上下两个区域用20ml 注射器注射混悬液，每点注射2ml注入到皮下层，形成圆形隆起并标记，对照组注射生理盐水。因混悬液中β-磷酸三钙生物陶瓷颗粒较大，均采用16G注射针头进行注射，注射后为防止混悬液漏出，进行缝合（图1）。

1.3观察指标

1.3.1外观:观察兔背部注射区皮肤外观有无红肿等变化，进行皮肤隆起区直径大小的测量并记录变化。

1.3.2组织学观察：在第2、4、12 周三个节点每组提取部分注射组织，进行组织切片，分别行HE染色及bmp2免疫组化染色。

2　结果

2.1混悬液的性状：A、B两种混悬液均具有良好的流动性，适合通过注射器进行推注，其颗粒大小适用于20ml注射器并16G针头进行注射（图2）。

2.2大体观察：注射1d后兔活动正常，注射两组大白兔背部注射部位的皮肤隆起，无异常表现，对照组皮肤隆起消失，已经正常；2周时，混悬液包块与皮肤之间的连接不够紧密，有晃动现象；A、B两组注射隆起范围有不同程度减少，皮肤正常，无红肿及等炎性反应，对照组已经一切正常；4周时，发现混悬液包块与皮肤之间的连接较为紧密，无明显晃动现象，注射隆起范围进一步减小，A、B组无明显差异；各组注射部位的皮肤无明显炎症反应；12 周时，发现混悬液包块与皮肤之间的连接紧密，无晃动现象；A、B组大白兔注射隆起范围进一步减少，皮肤稍有隆起，触之柔软。

2.3局部测量注射部位的直径大小变化：局部注射后直径变化，注射后当时A组局部形成肿块的直径平均值为：62.04mm；2周后直径平均值为：47.05mm；1个月直径平均值：42.40mm；3个月直径平均值：34.33mm。注射后两周平均吸收24.16%；注射后1个月平均吸收32.24%；注射后3个月平均吸收44.66%。B组注射当时直径平均值为：61.34mm；2周后直径平均值为：45.08mm；1个月直径平均值：41.60mm；3个月直径平均值：35.46mm；注射后2周平均吸收26.51%；注射后1个月平均吸收32.18%；注射后3个月平均吸收42.19%；A、B组的直径减少率随着时间的增加而增大，但无统计学差异。

2.4组织学观察：2周时发现混悬液包块仍然与皮肤之间的连接不够紧密，有晃动现象；常规包埋后，进行常规HE染色观察发现，陶瓷颗粒为不透光物质，所以光镜下为黑色团块，颗粒与周围组织之间界限清楚，没有明显连接，无明显的纤维包膜形成，无明显炎性细胞浸润（图3）。4周时发现混悬液包块与皮肤之间的连接较为紧密； HE染色观察发现，陶瓷颗粒与皮肤组织连接明显，但组织形态不明显，细胞分布也较为疏密，周围无明显炎性细胞浸润无纤维包膜形成（图4）；12周时观察，发现混悬液包块与皮肤之间的连接紧密； HE染色观察发现，光镜仍能观察到的陶瓷颗粒，颗粒周围皮肤组织形态典型，可见颗粒与皮肤组织连接紧密，同时细胞分布致密（图5）。

免疫组化显示：没有BMP2（骨形成蛋白2）阳性结果出现，即各组别中没有BMP2的表达（图6）。

图1　混悬液注射到兔背部皮下

图2 混悬液形成均匀，流动性好

图3　2周时颗粒与周围组织之间界限清楚，没有明显连接（400×）

图4　4周时陶瓷颗粒与皮肤组织连接明显，但组织形态不明显，细胞分布也较为疏密（400×）

图5　12周时光镜仍能观察到的陶瓷颗粒，颗粒周围皮肤组织形态典型，可见颗粒与皮肤组织连接紧密，同时细胞分布致密（400×）

图6　免疫组化显示：没有BMP2（骨形成蛋白2）阳性结果出现，即各组别中没有BMP2，的表达（400×）

3　讨论

生物材料的替代治疗是现代整形外科重要的治疗手段之一［8］。近年来，注射美容技术和相关产品的发展为微创治疗提供了可能，通过注射方式将填充剂直接注入需要的层次，并捏塑成型，达到纠正面部缺损、凹陷，直至形成完美的外观。注射填充的发展主要取决于填充剂的研究与开发，面部的骨性缺损、发育不良及软组织凹陷所致的畸形及外观欠佳已经成为目前整形美容外科最常见的诊疗项目。传统的手术方法有着良好的效果，但带来创伤及并发症较多。有些由于骨性结构的缺损，凹陷甚至发育不足（如小颏畸形）导致的畸形及不完美，通过透明质酸等软组织填充剂来改善，硬度及塑形性满足不了临床需要，最后呈现的效果也不尽理想［9-10］。

β-磷酸三钙生物陶瓷是一种骨填充材料，主要应用在骨科、口腔、整形、眼科、耳鼻喉科及组织工程等领域的临床骨缺损的填充及非荷重部位的骨缺损治疗。β-磷酸三钙具有良好的生物相容性。研究表明，新西兰白兔种植试验可见周围组织长入材料中，β-磷酸三钙生物陶瓷在体内能被完全为钙和磷，一般1～2年基本降解吸收［11-12］。

本实验以β-磷酸三钙生物陶瓷颗粒与透明质酸形成混悬液制备成新的注射填充材料。在动物体内进行植入，观察组织学反应，提取的组织切片均显示注射材料不会引起组织产生炎症反应，随时间推移组织细胞与材料结合紧密，说明制备的新填充材料具有较好的组织相容性。本实验采用的是无交联的玻尿酸，故注射后透明质酸2周左右即吸收结束，β-磷酸三钙生物陶瓷则可以长期持续，3个月还保持原有形态，说明其填充效果良好，代谢时间长，形态维持良好，临床上塑形性强［13］。同时，免疫组化提示BMP2无显示，骨形态发生蛋白2是一种分泌性多功能蛋白，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复［14-15］；BMP2的出现提示局部有成骨的表现，本实验结果显示无BMP2的表达提示注射材料周围无成骨现象，说明β-磷酸三钙生物陶瓷在软组织中不会诱导成骨，可以安全作为组织填充剂进行应用。本实验采用了β-磷酸三钙生物陶瓷与透明质酸3∶17及3∶12的比例进行配置，大于3∶12比例配置后粘滞度太大，不利于注射推注，但怎样配置更好，配置比例如何才能达到最好效果，还有待于进一步研究，同时将注射β-磷酸三钙生物陶瓷注入到骨膜下能否诱导成骨，是否能为骨缺损提供骨修复的可能也需要进一步研究。

本实验证实将透明质酸与β-磷酸三钙生物陶瓷颗粒进行混合形成混悬液进行注射治疗可行性较高，注射后与周围组织相容性好，无排斥及变态反应发生，β-磷酸三钙生物陶瓷颗粒与透明质酸混悬液作为一种新型注射类填充剂的尝试还需要进一步的研究。

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Experimental study onβ-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite on injectable tissue filler

LIU Qing-yang1，LU Jian-xi2，ZHOU Zhi-hua3，GUO Xin-wen1，PAN Shu-ya1，LI Ping1，YAO Chen-wei2
（1.Department of Plastic Surgery，Shanghai RENAI Hospital，Shanghai 200235，China； 2.Shanghai Bio-Lu Biomaterials CO.，Ltd，Shanghai 201114，China； 3.Shanghai First People's Hospital，Shanghai 200080，China）

Objective The purpose of this study was to observe the effection of β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite as a new kind of tissue fller. Methods β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite were used to make two kinds of composite （A，B） for different proportion （3∶17， 3∶12）. Physiological saline was control group. Twelve new Zealand rabbits were divided into 3 groups. The composites were injected randomly on the back of rabbit. Some of the rabbits were killed to be evaluated with histology at the time points 2，4 and 12 weeks after injection. Results No rejection and infammation were found on the back of the rabbits of A and B. Fiber tissue surrounding the composite was not pronounced. No osteogenesis phenomenon（bone morphogenetic protein2） were found at 1-12 weeks postoperatively. Conclusion β-Tricalcium Phosphate / Hyaluronic acid composite has good tissue compatibility and plasticity.It was not toxic and slow absorption.It did not produce Osteogenesis phenomenon in the soft tissue.This composite may become a new kind of injectable fller.

β-Tricalcium Phosphate； Hyaluronic acid； injection； tissue fller；bone morphogenetic protein2

R318

A

1008-6455（2016）08-0044-03

2016-05-15

2016-07-26

编辑/张惠娟

上海市卫生和计划生育委员会科研课题资助项目（20134284）