狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用

黄琼

（1.四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610041；2.成都康华生物制品有限公司 四川成都 610100）

狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用

黄琼

（1.四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610041；2.成都康华生物制品有限公司 四川成都 610100）

目的 建立狂犬病毒滴度的快速、经济的检测方法——噬斑法（PFU），验证其与小鼠脑内攻击法（计算LD50）的相关性，并用于PM株狂犬病毒的滴度测定。 方法 狂犬病毒做10倍系列稀释，然后接种于单层BHK21细胞上， 37℃、5%CO2吸附1h后，加入覆盖液， 33℃、5%CO2培养7～10天后用1. 5%的结晶紫染色。用建立的噬斑法和小鼠脑内攻击法同时测定狂犬病毒的滴度，以比较两种方法的相关性和重复性。结果 两种方法测定狂犬病毒滴度的结果差异无统计学意义，相关系数为0.939，两种方法的检测结果呈良好的正相关性。结论 噬斑法可替代小鼠脑内滴定法检测狂犬病毒滴度。

狂犬病毒 病毒滴度 噬斑法 小鼠脑内滴定法

狂犬病是由狂犬病毒引起的一种迄今为止人类病死率最高的急性人畜共患传染病,患者主要是中枢神经系统发生病变,一旦发病,死亡率高达100%。目前,还没有有效的治疗狂犬病的方法,免疫接种疫苗是预防该病发生的最有效措施［1］。

目前,国内各企业包括药典推荐,在测定狂犬病毒滴度的时候,仍采用小鼠脑内滴定法,即采用通过测定小鼠50%致死量（LD50）来计算病毒滴度。该方法虽然传统、经典,但是需要使用大量动物、动物个体差异大、实验费用高、操作烦琐、需要操作人员操作技能熟练、人为干扰因素较多,且需要14天的实验观察判定结果,耗时较长。因此,寻找一种快速、准确、稳定、经济的替代方法成为了一种必然趋势。细胞PFU法,做为病毒滴定的另一种经典方法,它是用病毒感染、破坏健康的指示细胞,然后病毒继续增殖,继续破坏周围细胞,从而形成一个病毒感染的痕迹——空斑,通过有效的稀释,该方法能有效地反映样品中病毒的含量,并且通过使用相应病毒敏感细胞,能较快得到实验结果,快捷、经济、有效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验用病毒、细胞和动物

Pitman-Moore狂犬病毒固定株,购自美国维斯塔研究所。适应狂犬病毒生长的仓鼠肾细胞（BHK21细胞）。11～13g的昆明小鼠,购自成都达硕生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂及器材

MEM培养基,购自日水株式会社；小牛血清,购自兰州民海生物工程有限公司；甲基纤维素,购自SIGMA；结晶紫,购自天津市科密欧化学试剂有限公司。6孔细胞培养板。

1.2 方法

1.2.1 噬斑法

将病毒样品进行10倍系列稀释,接种至已铺满单层指示细胞的6孔细胞培养板中,0.2ml/孔。然后于5% CO2、37℃条件下吸附1h,每隔10～15min轻摇板一次,然后加入覆盖液（用1%的甲基纤维素溶液配制的MEM溶液）,4ml/孔。

于5% CO2、33℃培养7～10天后,弃去覆盖液,加入1.5%结晶紫染色液,1～3ml/孔,30～40min后弃去染色液,用自来水冲洗至流水无色透明,细胞培养板孔内噬斑清晰可见。统计各孔蚀斑数,计算结果。

1.2.2 小鼠脑内滴定法

将病毒样品进行10倍系列稀释,脑腔接种11～13g的昆明小鼠,每个稀释度注射6只,0.03ml/只。连续观察14天,每天记录死亡及典型发病情况,3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内,计算LD50。

表1 两种方法病毒滴度检测结果比较Table 1 The comparison results of two methods testing the virus titer

2 结果

取20份病毒液样品分别用噬斑法和小鼠脑内滴定法测定病毒滴度,结果见表1。噬斑法测得的lgPFU/ml值的范围为5.2～7.3,平均值为6.24,用小鼠脑内滴定法测得的lgLD50/ml l值的范围为4. 9～7.0,平均值为6.14,经统计分析,这两种方法的测定结果差异无统计学意义（P=0.610）,相关系数为0.939,说明这两种方法的检测结果呈良好的正相关性。

3 讨论

在国内外,关于使用体外细胞滴定法替代小鼠脑内滴定法的研究一直未曾间断,且已证实两种方法具有相关性［2］,如今国内外对小鼠脑内滴定法的替代法的研究,主要集中于免疫荧光法（FFU）［3］,该方法更快捷,但是需要购买的狂犬病特异性单克隆抗体较贵,而且需要配置荧光显微镜,在不具备这些条件的情况出发,根据病毒滴度指标对生产过程控制、指导的意义的程度考虑,我们决定选择更经济、较快捷的噬斑法进行研究分析,将其测定的病毒滴度结果与小鼠脑内滴定法的检测结果进行了比较,结果表明两种检测方法的测定结果具有良好的一致性,且通过不同实验人员对相同样本进行重复测定,证实使用噬斑法测定狂犬病毒滴度是准确、可靠的,而且该方法操作更简便、更容易操作,实验人员操作误差更小,大大降低了人为因素的干扰,不使用实验动物,也大大降低了检验成本（包括经济成本和时间成本）。

［1］张永振，俞永新，董关木等.中国狂犬病的流行病学特征及防治建议［J］.中华预防医学杂志，2007，41（3）：165-168.

［2］朱蓉，薛红刚，徐葛林.应用细胞法代替小鼠法检测狂犬病病毒毒力［J］.中国生物制品学杂志，2006，19（1）：87-88.

［3］柴苗，徐葛林，孙文，卢颖，毕军，陈雪婷.细胞荧光转化灶单位实验体外滴定狂犬病病毒毒力方法的优化［J］.中国疫苗和免疫，2010，16（3）：258-260.

R-33

A

1674-2060（2016）03-0318-01