灰茶尺蛾性信息素的初步研究

罗宗秀，李兆群，蔡晓明，边磊，陈宗懋*



灰茶尺蛾性信息素的初步研究

罗宗秀1,2，李兆群1，蔡晓明1，边磊1，陈宗懋1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所农产品质量安全研究中心，浙江杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

灰茶尺蛾是我国茶园中重要的食叶害虫。本研究对求偶高峰期的灰茶尺蛾雌虫，采用正己烷浸提腹部末端方法提取性信息素，利用气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）筛选性信息素提取物中的活性成分，运用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对活性成分进行鉴定，最后将人工合成的性信息素进行田间诱捕试验。GC-EAD结果显示，灰茶尺蛾性信息素提取物中有两种成分可引起雄虫触角的电位反应。GC-MS分析结果确定两种活性成分分别为顺3,顺6,顺9-十八碳三烯（Z3,Z6,Z9-18:H）和顺3,顺9-6,7-环氧十八碳二烯（Z3,epo6,Z9-18:H）。田间引诱试验表明，不同比例性信息素在田间显示不同的引诱效果，当Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H以4∶6的比例配比，总剂量为1 mg时，田间引诱效果最佳。该研究结果为灰茶尺蛾性信息素的应用研究提供了理论基础。

灰茶尺蛾；性信息素；鉴定

灰茶尺蛾（Warren）属于鳞翅目（Lepidoptera）尺蛾科（Gometridae），是一种危害十分严重的茶树食叶害虫，主要分布于湖南、湖北、江西、浙江、广东和云南等茶区，幼虫咀食茶树叶片，严重时可致茶丛光秃[1]。由于灰茶尺蛾与茶树的另一种重要害虫——茶尺蠖（Prout）的形态特征极为相似且生态域有重叠，容易混淆，给害虫防治造成了诸多不便。张汉鹄等[1]和朱俊庆[2]先后对灰茶尺蛾和茶尺蠖的外部形态及生物学习性进行了描述。姜楠等[3]利用分子生物学技术进行分子特征分析，结合经典形态学分类方法鉴别出灰茶尺蛾和茶尺蠖这两种尺蛾。然而Zhang GH等[4]的研究则认为，目前茶尺蠖只是存在两个明显的分化枝（Clade）。昆虫性信息素是具有种的专化性的化学通讯物质，可作为判断和鉴别近似种的一种辅助手段。目前，灰茶尺蛾性信息素研究还未见文献报道，本试验对此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试虫源

实验所用灰茶尺蛾采自浙江省嵊州市明山茶场。灰茶尺蛾幼虫带回实验室采用茶枝饲养，养虫室温度(24±2)℃，相对湿度70%±5%，光周期16（光照）∶8（黑暗）。幼虫饲养至化蛹，将蛹按雌雄分开放置在不同的养虫笼（50 cm×50 cm×50 cm）内等待羽化。羽化后成虫饲喂10%的蜂蜜水，其中雌蛾用于提取性信息素，雄蛾用于性信息素提取物的活性测定。为避免试验用虫中混入茶尺蠖，所有供试成虫参考姜楠等[3]的方法，采用形态学与分子特征鉴定确定为灰茶尺蛾。

1.1.2 主要仪器与材料

气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）：气相色谱（美国Agilent Technologies公司，7890A）、触角电位仪（荷兰Syntech公司）；气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（日本Shimadzu公司，GC/MS-QP2010）；氮吹仪（Handiness Technologies公司）；船形诱捕器（漳州市英格尔农业科技有限公司）；缓释橡胶塞（白色，口径8 mm，美国Sigma Aldrich公司）；样品瓶（1.5 mL进样瓶，美国Agilent Technologies公司）；DB-23毛细色谱柱（内径0.25 mm，长度30 m，膜厚0.25 μm，美国Agilent Technologies公司）；Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H参考Ando等[5]的方法，以亚麻酸甲酯为底物合成（杭州泽泉生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 灰茶尺蛾性信息素的提取

性信息素提取采用正己烷浸提法。灰茶尺蛾羽化第2天进入暗周期4 h后，选择求偶状态下的处女雌蛾，用镊子轻轻挤压雌蛾腹部，待其产卵管露出后，自第8腹节用眼科手术剪剪下（图1）。剪下后的腹部末端放入装有150 μL正己烷的样品瓶浸提15 min，粗提物用无水硫酸钠脱水和氮吹浓缩后密封置于冰箱中（－20℃）保存备用。

图1 灰茶尺蛾性信息素浸提的腹部末端

1.2.2 灰茶尺蛾性信息素提取物的GC-EAD分析

GC-EAD装配DB-23毛细色谱柱（30 m×250 μm，ID：0.25 μm）。出口端1∶1分流，一部分进入FID氢火焰离子检测器，另外一部分经过加热套流出GC，刺激EAD电极上的触角。GC载气为N2，不分流进样，升温程序为：起始温度50℃，保持2 min，以10℃·min-1的升温速度升至160℃，再以4℃·min-1的速度升到220℃，保持5 min。GC-EAD分析时，选择羽化第2天的灰茶尺蛾雄虫，用刀片将其触角自基部切下，端部切除少许，用导电硅胶将触角粘于EAG电极的固定器上。进样1 μL性信息素提取物，计算机记录下分析数据，以此筛选出性信息素提取物中的活性成分。

1.2.3 灰茶尺蛾性信息素活性成分的GC-MS分析

GC-MS分析灰茶尺蛾性信息素活性成分，GC-MS中的GC升温程序、色谱柱型号与GC-EAD分析时一致，载气为He。MS电离方式EI，电离能量为70 eV，离子源发生器温度为250℃，质量扫描范围为m/z 40~m/z400。分析时进样性信息素提取物1 μL，结合GC-EAD分析结果以及蛾类性信息素特征离子进行定性。

1.2.4 灰茶尺蛾性信息素田间诱捕试验

灰茶尺蛾性信息素田间诱捕试验于浙江省绍兴御茶村茶业有限公司茶叶基地进行。试验所用人工合成性信息素Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H（纯度>95%）溶解于正己烷。将性信息素正己烷溶液加入缓释橡胶塞中，空白对照为添加正己烷的橡胶塞。性信息素橡胶塞置于船形诱捕器中，每个处理3次重复。船形诱捕器棋盘式随机布置于灰茶尺蛾发生的茶园，每个诱捕器高1.4 m，间隔15 m，统计21 d诱捕虫数。诱捕的雄蛾带回实验室进行形态学与分子特征鉴定。田间调查数据采用SPSS软件单因素方差分析，数据通过lg(+1)转换后进行Tukey’s-b分析。

2 结果与分析

2.1 灰茶尺蛾性信息素鉴定结果

如图2所示，GC-EAD分析灰茶尺蛾性信息素提取物，显示采用正己烷浸提法提取的性信息素粗提物中共有两个活性成分可以引起雄蛾触角电生理活性，其中活性成分1的保留时间为11.47 min，活性成分2的保留时间为15.25 min。

图2 灰茶尺蛾性信息素粗提物GC-EAD图

与GC-EAD相同色谱条件下对性信息素提取物进行GC-MS分析，得到了总离子流色谱图（图3），根据出峰顺序、相对保留时间，以及鳞翅目类型2性信息素特征离子锁定两个活性成分色谱峰，活性成分1的保留时间为13.91 min，活性成分2的保留时间为19.08 min。

如图4所示，活性成分1的质谱离子峰m/z 41，55，67，79，93，108，121，135，149，248，通过与标准品的保留时间、质谱信息对比，最终确定活性成分1鉴定为顺3,顺6,顺9-十八碳三烯（Z3,Z6,Z9-18:H）。

如图5所示，活性成分2的质谱离子峰m/z 41，55，67，83，95，111，121，137，151，264，通过与标准品的保留时间、质谱信息对比，最终确定活性成分2鉴定为顺3,顺9-6,7-环氧十八碳二烯（Z3,epo6,Z9-18:H）。

2.2 灰茶尺蛾性信息素田间诱捕效果

田间诱捕结果表明，Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H确为灰茶尺蛾性信息素。Z3,Z6,Z9-18:H单独使用无引诱效果，而Z3,epo6,Z9-18:H单独使用具有引诱效果，当二者混合时对雄蛾具有较好的引诱活性（图6）。数据统计分析发现，不同比例的性信息素组合表现出不同的引诱效果，其中Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H以4∶6的比例混合，总剂量为1 mg时，引诱效果最佳，21 d的诱捕虫数达每个诱捕器（41.7±6.8）头，效果优于其他处理（表1）。

注：图中所示为诱捕器悬挂7 d，调查引诱虫数时性信息素所表现的引诱效果。

表1 灰茶尺蛾性信息素化合物的田间引诱结果

注：数据为平均值±标准误，同列数据后不同小写英文字母表示在0.05水平上单因素方差分析差异显著。

Note: Average±standard error, different lowercase in the same column meant significance difference (<0.05).

3 讨论

本研究表明，在灰茶尺蛾雌蛾求偶高峰期，采用正己烷浸提雌虫腹部末端的方法可以成功提取对灰茶尺蛾雄虫触角具有电生理活性的性信息素粗提物。从GC-EAD分析图谱可以看出，正己烷浸提腹部末端法提取的性信息素粗提物虽然具有较多的杂质，但由于灰茶尺蛾个体较大，性信息素含量较高，因此不影响分析，是一种经济、方便的性信息素提取方法[6]。GC-MS鉴定灰茶尺蛾两种性信息素成分为Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H，与大部分尺蛾科蛾类一样，其性信息属于典型的类型2性信息素结构[7]。性信息素成分的协同效应在灰茶尺蛾求偶通讯中起着重要作用，田间诱捕试验显示，当两种性信息素化合物以特定比例混合后对雄蛾具有更好的吸引作用，田间引诱活性更为理想。田间诱捕结果验证了灰茶尺蛾性信息素鉴定的正确性。本研究结果可为进一步研究性信息素的大量诱杀和交配干扰技术提供理论基础。

目前，茶树蛾类中茶尺蠖性信息素已由我国科学家鉴定，但其活性组分的报道并不完全一致[8-10]，本研究又鉴定出灰茶尺蛾的性信息素。在灰茶尺蛾和茶尺蠖性信息素的研究上存在两个不确定因素：首先，灰茶尺蛾和茶尺蠖究竟是不同的独立种还是一个种中的“分化枝”似乎尚未有定论[3-4]；其次，以往的研究中所使用的材料究竟是灰茶尺蛾还是茶尺蠖还不能肯定。因此在进行性信息素研究的同时，对灰茶尺蛾和茶尺蠖的形态和命名也有进一步核实的必要。如果是独立的两个种，那么这两种茶树尺蛾近缘种如何实现求偶通讯的种间隔离是一个值得深入研究的科学问题。性信息素化合物结构、比例、剂量的特异性通常是蛾类近缘种求偶通讯种间隔离的主要方式[11-16]。对比发现，灰茶尺蛾和茶尺蠖性信息素的主要成分均为Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H，其中么恩云等[9]研究发现，除以上两种组分外，顺3,顺6,顺9-二十二碳三烯（Z3,Z6,Z9-22:H）和顺3,顺6,顺9-二十四碳三烯（Z3,Z6,Z9-24:H）对茶尺蠖具有引诱作用，因此微量组分在两种尺蛾求偶通讯种间隔离中的作用需进一步研究。此外，近缘种常常通过手性异构实现求偶通讯种间隔离[17-19]，两种尺蛾的性信息素主要成分Z3,epo6,Z9-18:H的环氧烯烃结构有手性中心，因此两种尺蛾的性信息素立体化学结构同样值得深入研究。以上因素均有可能导致求偶通讯的隔离现象，只有阐明这两种尺蛾近缘种求偶通讯的种间隔离机制，才能更好地指导性信息素的应用技术研究，同时丰富茶树蛾类近缘种的性选择分化及求偶通讯系统的进化理论。

参考文献

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A Primary Study on Sex Pheromone of

LUO Zongxiu1,2, LI Zhaoqun1, CAI Xiaoming1, BIAN Lei1, CHEN Zongmao1*

1. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Warren is a severe defoliator species in tea garden of China. In this study, the sex pheromone was extracted from abdominal tips of virgin female moths by n-hexane during peak calling period. Analysis of gland extracts by gas chromatography (GC) with electroantennographic detection (EAD) and the components of sex pheromone were identified by gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS). Finally, the biological activity of synthetic sex pheromone was evaluated by field trapping. The result of GC-EAD revealed two components that elicited responses from male moth antennae. Based on the mass spectrum, two components were identified as (Z,Z,Z)-3,6,9-octadecatriene and (Z,Z)-3,9-cis-6,7-epoxy-octadecadiene. In field experiment, different attracting effects were identified under different ratio of sex pheromones. Experiment showed the ratio of 4:6 of these synthetic components showed the maximum attractiveness at 1.0 mg when loaded on rubber septum. This investigation provides a theoretical basis for developing sex pheromone application technology againest.

, sex pheromone, identification

S435.711；Q968.1

A

1000-369X（2016）05-537-07

2016-03-24

2016-04-18

国家重点研发计划项目（2016YFD0200900）、现代农业产业技术体系项目（CARS-23）、中国农业科学院创新工程

罗宗秀，男，博士研究生，助理研究员，主要从事茶树害虫化学生态学研究。

zmchen2006@163.com