UPLC-MS/MS法测定牛奶中普鲁卡因青霉素G残留量

陈　雪, 林　婷

(上海德诺产品检测有限公司,上海　200436)



UPLC-MS/MS法测定牛奶中普鲁卡因青霉素G残留量

陈雪, 林婷

(上海德诺产品检测有限公司,上海200436)

建立一种UPLC-MS/MS法(超高压液相色谱-串联质谱法)测定牛奶中普鲁卡因青霉素G的快速方法。采用正离子电离模式和MRM扫描模式。设置1.0，3.0，5.0 μg/kg 3个加标水平，测定加标回收率。结果表明利用UPLC-MS/MS检测的普鲁卡因青霉素G在1.0～20.0 ng/mL的浓度范围内呈良好线性关系。3个加标水平的加标回收率为94.6～101.1%，相对标准偏差为1.3%～2.1%，检出限为1.0 μg/kg。该方法快速，灵敏，准确，可满足普鲁卡因青霉素G残留量的测定。

超高压液相色谱-串联质谱法；普鲁卡因青霉素G；定量；牛奶

普鲁卡因青霉素是内酰胺类抗生素，在青霉素G的基础上研制出来的下一代长效青霉素，其克服了青霉素G作用时间短的缺点，主要用于革兰氏阳性菌感染，亦用于放线菌及钩端螺旋体等感染[1]。为了尽量降低药物在乳品中的残留，杜绝其对人类健康的危害，人们对抗生素残留的日益重视。在客观上需求更快速精确的检测方法，来确保检测结果更加的准确可靠。其中包括微生物检测法(纸片法、杯蝶法、TTC法[2])、理化检测法(高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、比色法、荧光分光光度法)、免疫法(ELISA)[3-6]。王超等[4]将奶样用乙腈提取，离心分离经C18净化后，通过高效液相色谱紫外检测器测定牛奶中青霉素G、青霉素V、邻氯青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素等5种青霉素。

检测方法在一定程度上也存在不足之处。对于传统微生物检测方法来说，其检测时间长，检测过程中不易筛选到特别敏感的菌株，且易受其他抗菌药物的影响，对结果的判断主要通过肉眼，易产生误差。理化检测方法如薄层色谱法需要复杂的样品前处理，且灵敏度不高、不易定量、重现性不好。免疫分析法相关试剂盒的检测费用较高。

色谱-质谱联用技术实现高效层析分离和检测，其特异性、灵敏度和重复性均好，一般兼具分离、定量和定性(分子结构信息)[7]。近年来，超高效液相色谱(UPLC)越来越普及，可用于检测牛奶中青霉素类抗生素的快速检测[8]。本研究通过UPLC-MS/MS方法对样品进行分析，建立灵敏、稳定、快速的牛奶中普鲁卡因青霉素G的定量检测方法。

1　实　验

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

乙腈，购于德国Merck公司；甲酸，购于美国Sigma公司；C18粉末，购于天津博纳艾杰尔科技有限公司；普鲁卡因青霉素G标准品：纯度>99.9。

1.1.2仪器设备

超高效液相色谱—串联质谱仪，ESI源，Water XEVO TQ 型，购于美国沃特世公司；高速冷冻离心机，Sorvall ST16R型，购于Thermo公司；涡旋振荡器，Talboys型，购于上海安谱科学仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1样品前处理

称样品(5±0.05)g于50 mL离心管中，加30 mL乙腈，混匀，超声30 min，8000 r/min离心5 min。取10 mL于另一试管中，加入200 mg C18粉，漩涡混匀1 min，后8000 r/min离心5 min 取6 mL上清于罗马管中，氮气吹干。加1 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈溶解干物，过0.22 μm有机相滤膜后，测定。

1.2.2超高效液相色谱条件

色谱柱选用ACQUITY UPLCBEH C18柱；流动相为含有0.1%甲酸的水溶液-乙腈；流速为300 μL/min；进样量为5.0 μL；梯度洗脱见表1。

表1　流动相梯度洗脱条件Table 1　Gradiend elution table of the mobile phase

1.2.3质谱条件

离子源为电喷雾离子源，正离子模式，多反应检测；离子源温度为150 ℃；毛细管电压为2.0 kV；雾化温度为400 ℃；雾化气流速为800 L/h；定性、定量离子对及的锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2　普鲁卡因青霉素G的质谱参数Table 2　The MS parameters of Penicillin G Procaine

2　结果与讨论

2.1仪器分析条件的优化

本实验的流动相使用了含有0.1%甲酸的水溶液，可以增加普鲁卡因青霉素G离子化程度，提高灵敏度。本方法能够使普鲁卡因青霉素G与基质中的杂质分离，并使实验结果得到良好的稳定性和重现性。

将普鲁卡因青霉素G标准品溶液直接进样，确定化合物母离子后，进行二级质谱扫描，得到碎片离子，得到二级质谱图。选择其中相对丰度较高的离子对，为定性定量离子对。优化后的毛细管电压、锥孔电压、碰撞电压等参数条件见表2。

2.2线性范围和检出限

取牛奶样品进行处理，以得到的基质溶液配制标准曲线，曲线浓度为0，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 ng/mL。以目标组分峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得其回归方程及相关系数见表3。

表3　普鲁卡因青霉素G加标的回归方程和相关系数Table 3　Linear equations and correlation coefficients for Penicillin G Procaine in milk

由表3可知，在浓度为1.0～20.0 ng/mL的范围内普鲁卡因青霉素G的测定具有良好的线性关系。普鲁卡因青霉素G标准溶液的色谱图见图1。由图1可知，1.0 ng/mL的普鲁卡因青霉素G响应值良好。

图1　普鲁卡因青霉素G标准品的 MRM 色谱图Fig.1　MRM chromatogram of Penicillin G Procaine standards

2.3方法的准确度和精密度

本方法选择了1.0，3.0，5.0 μg/kg 3水平的添加回收实验，得到各添加水平进行的6次平行测定结果，平均回收率和精密度见表4。

表4　普鲁卡因青霉素G在牛奶中加标回收率及精密度测定结果Table 4　Recoveries and relative standard deviations of Penicillin G Procaine in milk

由表4可知，添加不同含量的普鲁卡因青霉素G，其平均回收率达到94.6%～101.1%，且相对标准偏差小于10%，标明该方法对不同含量的普鲁卡因青霉素G的测定具有良好的准确度和精密度。

3　结　论

本实验建立了超高效液相色谱—串联质谱法测定牛奶中的普鲁卡因青霉素G的检测方法。采用了乙腈提取目标物质，提取液经C18粉末吸附净化处理和C18色谱柱分离后，串联质谱检测。结果表明此方法操作简便快捷，准确度和精确度好，能够有效地对牛奶中普鲁卡因青霉素G进行残留分析。

[1]邓斌,邓春来,张曦.高效液相色谱法检测牛奶中青霉素残留的研究进展[J].中国兽药杂志,2003,37(6):36-40.

[2]杨秀娟,张曦.动物源食品中抗生素残留监测分析方法的研究[J].饲料广角,2004(18):25-27.

[3]孙伟,焦奎,张书圣.酶联免疫分析法研究进展[J].青岛化工学院学报,2001,22(3):209-214.

[4]王超,李淑娟.测定牛奶中5中青霉素残留量的高效液相色谱柱前衍生法[J].分析测试学报,2002,19(6):72-74.

[5]黄晓蓉,于兢,郑晶,等.牛奶中β-内酰胺抗生素残留的快速检测方法[J].中国乳品工业,2004,32(2):41-47.

[6]宋华宾,李爱民.对牛乳中几种抗生素的定性检验方法的研究[J].中国乳品工业,1992,20(2):63-64.

[7]林维宣,孙兴权,田兴,等.液相色谱-串联质谱法检测牛乳中多肽类抗生素残留量[J].中国乳品工业,2009,37(3):46-48.

[8]薄海波,雒丽丽,曹彦忠,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中6中聚醚类抗生素残留量[J].分析化学,2009,37(8):1161-1166.

Quantification of Penicillin G Procaine in Milk by UPLC-MS/MS

CHENXue,LINTing

(Shanghai Deno Products Testing Service Co., Ltd., Shanghai 200436, China)

UPLC-MS/MS quantification of Penicillin G Procaine was built in milk. Qualitative analysis was performed with electrospray ionization in positive mode(ESI) under multiple reaction monitoring(MRM) mode. There spiked concentration levels of 1.0 μg/kg, 3.0 μg/kg, 5.0 μg/kg were set for the determination of the recovery. The result showed that procaine quantification with UPLC-MS/MS had a linear relationship in the range of 1.0～20.0 ng/mL. The average recoveries of the three spiked concentration levels were in the range of 94.6%～101.1% with RSD of 1.3%～2.1% at 1.0～5.0 μg/kg (n=6). The method is rapid, sensitive and accurate, which can meet the detection requirements of Penicillin G Procaine residues in milk.

UPLC-MS/MS; Penicillin G Procaine; quantification; milk

陈雪(1987-)，女，硕士，助理工程师。

S859.84

B

1001-9677(2016)018-0149-02