纤维素酶——半纤维素酶提取泡姜姜辣素*

杨　毅，叶树帆，任小丽，崔秋兵

(内江师范学院化学化工学院，四川　内江　641100)



纤维素酶
——半纤维素酶提取泡姜姜辣素*

杨毅，叶树帆，任小丽，崔秋兵

(内江师范学院化学化工学院，四川内江641100)

对纤维素酶和半纤维素酶联合提取泡姜姜辣素的工艺进行研究。以泡姜粉为原料，50%乙醇作溶剂。选择香草醛作为标准对照品，通过紫外分光光度法，在280 nm处测定提取液中姜辣素的含量。通过单因素实验和正交优化设计实验，得到最佳提取条件：固液比2:200(g:mL)，混合酶加量3 mg，酶解温度45 ℃，酶解时间2 h，泡姜姜辣素的提取率为1.69%。

纤维素酶；半纤维素酶；泡姜；姜辣素

生姜含有辛辣成分和芳香成分，其芳香成分是姜精油，具有挥发性；其辛辣成分是姜辣素(姜酚)及分解物6-姜烯酚、8-姜烯酚，姜辣素的组分是由多种物质构成的混合物[1]，不具有挥发性。经研究发现，姜辣素是生姜诸多药用学价值的主要功能组分[2-3]。

姜辣素具有抑制血小板聚集、保护心血管、降血糖、改善胃肠道功能、增强免疫力、降血脂、抗炎、保肝利胆、抗微生物、抗衰老、防辐射、抗肿瘤等作用，还有很强的抗氧化能力。因此，姜辣素在食品、药品、化妆品、保健品等方面，具有很好的应用价值[4-7]。

泡姜属于四川传统的风味泡菜，其口感与生姜有很大不同，经过泡制，姜辣素的成分、含量及药用价值，是否发生变化，这些问题，见于报道的量很少，因此，其值得深入研究。目前，姜辣素的主要提取方法有，溶剂抽提法、压榨法、超临界CO2萃取、超声波或微波辅助提取等[8-10]。但上述方法，设备要求较高，工艺比较复杂，耗费时间长。纤维素在生姜细胞壁中的含量很高，使得姜辣素的溶出受到很大限制。姜辣素和其他成分主要通过浓度梯度逐渐扩散到溶剂中，这样既造成提取酶解时间长，耗用的溶剂多，又使得提取不完全。半纤维素是植物细胞壁中与纤维素共生的植物多糖，其含量仅次于纤维素，使用半纤维素酶将半纤维素转化成其他物质[11]，可以让姜辣素快速溶出。本实验采用生物酶技术提取泡姜中的姜辣素，以期探索出一种工艺简单、设备要求低、提取效率高的提取方法，为泡姜姜辣素的成分、含量、活性和应用提供理论基础。

1　实　验

1.1原料、试剂与仪器

泡姜：购自内江市农贸市场。

无水乙醇，成都金山化学试剂有限公司；香草醛，天津市巴斯夫化工有限公司；纤维素酶(50 U·mg-1)、半纤维素酶(20000 U·mg-1)，上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸、柠檬酸三钠，成都市科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。

SHA-B 双功能恒温水浴震荡器，上海玺袁科学仪器有限公司；TGL-10C高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-752紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，上海兴创科学仪器设备有限公司；DFY-600 600克摇摆式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司。

1.2实验方法

1.2.1泡姜粉的制备

将泡姜洗净切片，自然风干，然后于50 ℃下烘干至易折断为止。用粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存备用。

1.2.2姜辣素测定

目前，姜辣素的测定有溶出伏安法、高效液相色谱法、滴定法、荧光法、光度法、薄层扫描法、气相色谱或与质谱联用以及 LC/ESI- MS/MS法等。张明昶等[12]选用香草醛为标准对照品，将其无水乙醇溶液用紫外分光光度计进行扫描，在最大吸收波长，280 nm 处测定样品中的姜辣素含量，此法快速、高效、可行。

1.2.3香草醛标准曲线的绘制[13]

准确称取0.2 g香草醛，用50%乙醇溶解并定容成100 mL，准确移取5.0 mL到50 mL容量瓶中定容，配成200 μg/mL的标准溶液。并用50%乙醇配成2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的香草醛标准溶液。以溶剂作为空白，于280 nm处测定吸光度值。得回归方程：

A=0.06393c+0.031，R2=0.9993

1.3姜辣素的提取[14]

以1:1的比例将纤维素酶和半纤维素酶配制成混合酶溶液，用柠檬酸和柠檬酸三钠配制pH为 5.00的缓冲溶液，两者均以50%乙醇作为溶剂。准确称取0.15 g泡姜粉于25 mL具塞比色管中，加入2 mL酶液、8 mL缓冲溶液，在45 ℃下，水浴加热2 h。然后离心10 min，移取1 mL上清液用50%乙醇定容至10 mL，根据上述方法，检测溶液吸光度，计算提取率。姜辣素提取率的计算方法[15]如下：

式中：X——姜辣素产率，%

2.003——香草醛与姜辣素的换算系数

ρ——姜辣素质量浓度，μg/mL

V——待测液的总体积，mL

Q——稀释倍数

1.4泡姜姜辣素提取的单因素试验

准确称取0.1 g泡姜粉于具塞比色管中，以固液比为2:200、酶解温度为45 ℃、混合酶加量为10 mL(2 mL混合酶液和8 mL缓冲溶液)、酶解时间为2 h作为基础条件。在固定其他各因素水平条件下，分别考查固液比1:200、2:200、3:200、4:200、5:200(g:mL)，酶解温度30、35、40、45、50 ℃，混合酶加量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，酶解时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、2.5 h时对姜辣素产率的影响。

1.5正交设计优化泡姜姜辣素的提取

在单因素试验基础上，选定固液比、混合酶加量、酶解温度、酶解时间4个因素，设计L9(34)正交试验，据此选出最佳的提取条件。正交试验因素与水平表见表1。

表1　影响泡姜姜辣素提取率的因素水平表Table 1　Effect of pickled ginger oleoresin ginger extraction rate factor levels

2　结果与讨论

2.1单因素试验对于泡姜姜辣素提取率的影响

2.1.1固液比

在3Dmax中按照真实采集人体骨骼的比例，对模型进行调整，统一轴心与质心位置，制作出三维结构与真实模型一致的精细模型，如图2所示。

其他条件固定不变，在不同的固液比下，提取泡姜姜辣素的实验结果如图1。

由图1可得，随着固液比的减小，姜辣素产率逐渐增大，当固液比为2:200(g:mL)时，姜辣素产率出现最大值为1.42%，若继续减小固液比，产率反而有所减小。这可能是因为适当减小固液比时有利于姜辣素溶解到溶剂中，当固液比过小会造成其它杂质溶解到溶剂中去，造成姜辣素扩散速率降低，对溶解起到抑制作用。

图1　固液比对泡姜姜辣素提取率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.2混合酶加量

其他条件固定不变，在不同的混合酶加量下，提取泡姜姜辣素的实验结果如图2。

由于生物酶的作用非常高效，据图2可得，混合酶加量增大，提取率持续升高，在2 mg时，提取率达到1.42%，说明当酶加量为2 mg时足以对0.1 g泡姜细胞壁完全分解。再增加酶的用量会增加酶对提取物的副作用，使得产率会降低。

图2　酶加量对泡姜姜辣素提取率的影响Fig.2　Effect of enzyme dosage on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.3酶解温度

其他条件固定不变，在不同的温度下，提取泡姜姜辣素的实验结果如图3。

由图3可得，随酶解温度的增加，姜辣素产率迅速提高，当温度达到45 ℃时出现峰值1.54%，温度再增加，产率反而降低。这可能是因为酶可加快提取速率但酶对温度很敏感，在适当温度范围内，酶的活性随温度的增加而增强，当温度过高时，高温破坏了酶的活性，使得活性降低，产率减少。因此会在45 ℃时出现最大值。

图3　酶解温度对泡姜姜辣素提取率的影响Fig.3　Effects of temperature on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.4酶解时间

其他条件固定不变，在不同的酶解时间下，提取泡姜姜辣素的实验结果如图4。

由图4可得，随着酶解时间变长，姜辣素的提取率不断增加，在2.0 h达到最大，为1.43%，继续增加酶解时间，提取率有所降低。这可能是因为酶对姜辣素的提取有两个方面的作用：①破坏细胞壁使得姜辣素更容易溶解出来；②酶对姜辣素也有一定的降解作用。因此产率是由这两个因素共同决定的，在前期的时，第一个因素起主导作用，导致产率不断增加。在后期时，细胞壁基本上已被破坏，第二个因素将起主导作用，使得产率有所降低。因此图像会出现先增加后降低的趋势。

图4　酶解时间对泡姜姜辣素提取率变化的影响Fig.4　Enzymolysis time of pickled ginger ginger oleoresin extraction rate change

2.2正交试验优化与分析

根据单因素实验的结果，把姜辣素提取率作为目标参数，以固液比、混合酶加量、酶解温度、酶解时间4个因素进行正交试验，其结果见表2。

表2　正交试验结果表Table 2　Table of orthogonal test results

续表2

623121.61731321.54832131.43933211.46K11.4501.5101.4601.453K21.6071.5001.5401.553K31.4471.5231.5331.527R0.1570.0230.0800.100

由表2可得，把姜辣素提取率作为目标参数，4个因素对于泡姜姜辣素提取率的影响，按由大到小为：固液比>酶解时间>酶解温度>混合酶加量。直观分析表明，提取的最佳条件为A2B3C2D2，即固液比2:200(g:mL)，酶加量3 mg，酶解温度45 ℃，酶解时间2 h。因为最佳组合不在正交设计内，所以需要做验证试验。

2.3最佳工艺条件验证

根据正交设计试验选出的最佳组合A2B3C2D2做3次平行试验，得到姜辣素的平均提取率为1.69%，表明正交试验确定的组合条件为最优。

3　结　论

以生物酶酶解过程为主要工艺，50%乙醇作溶剂提取泡姜姜辣素，探索纤维素酶和半纤维素酶协同作用在提取泡姜姜辣素方面的应用。通过研究固液比、混合酶加量、酶解温度、酶解时间四个因素对提取率的影响，得知姜辣素的提取率受酶的影响较大，少量的酶即可明显提高产率。选用正交实验法。得到最佳的泡姜姜辣素提取条件为固液比2:200(g:mL)，酶加量3 mg，酶解温度45 ℃，酶解时间2 h，泡姜姜辣素的提取率为1.69%。此法工艺过程简单，设备要求低，快速可行，对泡姜活性成分的进一步研究有一定价值。

[1]战琨友, 王超, 徐坤, 等. 气相色谱-质谱技术分析姜油树脂中的挥发性及非挥发性成分[J]. 色谱, 2008, 26(6): 692-696.

[2]蒋苏贞, 宓穗卿, 王宁生. 姜辣素的化学成分研究概述[J]. 中药新药与临床药理, 2006, 17(5): 386-389.

[3]YEH SY, CHANG HC, Chen HC, et al. Bioactive components analysis of two various gingers (Zingiber offcinale Roscoe) and antioxidant effect of ginger extracts[J]. LWT-Food Sci Techonl, 2014, 55(1): 329-334.

[4]谢志刚, 唐德容, 李乐. 姜辣素的提制及抗氧化性能的研究[J]. 食品与机械, 2006, 22(5): 52-54.

[5]Masuda Y, Kikuzaki H, Hisamoto M, et al. Antioxidant properties of gingerol related compounds from ginger[J]. Biofactors, 2004, 21(14): 293-296.

[6]李佳琪, 郑毅男, 王昆, 等. 姜产品乙醇提取物抗氧化及抑菌活性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2015, 27(3): 480-484.

[7]严赞开. 生姜提取物的抑菌试验[J]. 中国食品添加剂, 2005(1): 74-76.

[8]杜秋叶, 李赫, 蔡成岗, 等. 超声波辅助提取生姜中姜辣素的工艺研究[J]. 广州化工, 2014,42(15): 73-75.

[9]朱沛沛,刘宁,巨敏, 等. 正交试验法优化生姜中姜辣素的提取工艺研究[J]. 农产品加工(学刊), 2012(2): 82-84+126.[10]李晓安. 姜辣素不同提取方法的比较研究[J]. 中国调味品, 2012, 37(2): 101-103.

[11]王琛, 石太渊. 双酶酶解法提取姜油树脂工艺优化[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 60-63.

[12]张明昶, 李健, 蒙继昭. 紫外分光光度法测定姜中姜辣素类化合物的含量[J]. 贵州医药,2003,27(3): 283-284.

[13]项敏, 罗炎烽, 王正裔, 等. 超声波提取生姜中姜辣素的工艺研究[J]. 山东化工, 2015, 44(11): 7-9,12.

[14]陈莉华, 左林艳, 唐玉坚. 微波辅助乙醇提取姜辣素及其对油脂的抗氧化性研究[J]. 食品科学,2011,32(4): 69-73.

[15]孔繁东, 王恋峰, 祖国仁, 等. 超声波辅助提取姜渣中姜辣素工艺研究[J]. 中国酿造,2010,29(1): 102-104.

Cellulase Hemicellulase-extract of Pickled Ginger Oleoresin*

YANGYi，YEShu-fan，RENXiao-li,CUIQiu-bing

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Neijiang Normal University, Neijiang,Sichuan 641100, China)

Cellulase and hemicellulase combined extraction of pickled ginger gingerol technology was researched with pickled ginger powder as raw materials, 50% ethanol as the solvent. Vanillin was selected as a standard control, on the basis of UV spectrophotometry, extraction of gingerol was determined in 280 nm. Through single factor experiments and orthogonal optimization experiment design, the optimum extraction conditions were obtained as follows: solid-liquid ratio of 2:200 (g:mL), mixed enzyme dosage of 3 mg, enzymatic hydrolysis temperature of 45 ℃, enzymolysis time 2 h, pickled ginger oleoresin extraction rate was 1.69%.

gellulase; hemicellulase; pickled ginger; oleoresin ginger

内江师范学院大学生创新创业科技项目(X201508)。

杨毅，男，研究方向：天然产物提取及合成研究。

崔秋兵，女，研究方向：中药及天然产物活性成分。

TS202.3

A

1001-9677(2016)018-0085-04