桦褐孔菌提取物影响α-糖苷酶活性研究*

沈心怡，刁苗璐，方妤露，张梦婷，陈　涛，朱长俊

(嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江　嘉兴　314001)



桦褐孔菌提取物影响α-糖苷酶活性研究*

沈心怡，刁苗璐，方妤露，张梦婷，陈涛，朱长俊

(嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴314001)

实验以桦褐孔菌子实体为材料，探究其提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响。用不同溶剂对桦褐孔菌子实体进行提取，并用提取物分别测定对α-糖苷酶活性的抑制率，结果显示石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、粗多糖四种提取物的IC50值分别为1.0 mg/mL；0.60 mg/mL；0.98 mg/mL；0.15 mg/mL，相较于阿卡波糖的IC50值20 mg/mL，可见桦褐孔菌中的活性成分具有显著的降血糖功能，其中粗多糖对α-糖苷酶活性的抑制效果最显著。

桦褐孔菌子实体；提取；α-葡萄糖苷酶；降血糖

目前多项研究表明，桦褐孔菌(Inonotusobliquus)具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗寄生虫等多种药理活性[1]，在抗病作用中菌丝和菌核中的糖蛋白和水溶性多糖有明显的降血糖作用[2]。目前在国外，桦褐孔菌的降血糖作用研究已成为热点[3]。在国内，高愿军[4]等通过实验表明桦褐孔菌多糖口服液能促进胰岛素分泌，促进肝糖原合成，降低血乳酸含量，有效降低糖尿病小鼠血糖。本实验通过对桦褐孔菌子实体粗粉进行提取，来初步确定子实体中抗糖尿病活性成分。阿卡波糖是一种非常有效的糖苷酶抑制剂，在临床医学上已经得到了广泛的认可[5]。通过将桦褐孔菌子实体的四种有机溶剂提取物与阿卡波糖对α-D-葡萄糖苷酶抑制作用进行依次比较，从而能够比较直观的观察桦褐孔菌子实体中提取物的降血糖功能的高低。

1　实　验

1.1原料、试剂及仪器

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)子实体(杭州百山祖生物科技有限公司)；95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，α-D-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、阿卡波糖(Acarbose)均为杭州普修生物科技有限公司。

主要实验仪器：RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FZ102微型植物粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；UV-1100紫外分光光度计，上海市美谱达仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1桦褐孔菌子实体的分步提取

1.2.1.1工艺流程见图1。

图1　试验流程示意图Fig.1　Schematic diagram of the experimental process

1.2.1.2原料制备

将桦褐孔菌子实体切成小块后用粉碎机粉碎，过60目筛，60 ℃热风干燥至恒重，备用。

1.2.1.3主要操作步骤

(1)取3.5 kg粗粉，加入8.5 kg 95%乙醇浸没，浸泡168 h，每天定时进行搅拌混匀。

(2)取适量上清液，三层纱布过滤，再抽滤，然后将滤液旋蒸至剩余少量；加石油醚萃取，得到有机相和水相，有机相旋蒸得到石油醚提取物；同理，在水相中用乙酸乙酯、正丁醇依次分步旋蒸萃取，最终上清液提取可得到石油醚提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物。

(3)取适量滤渣，乙醇蒸发晾干至无味，加入蒸馏水没过滤渣进行煮沸。待水沸腾后计时2 h，结束后用纱布过滤，再抽滤。最后进行蒸发浓缩，即可得到粗多糖部分。

1.2.2分步提取物降血糖活性研究

体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定

(1)配制pH为6.8的磷酸缓冲液磷酸缓冲液；

(2)PNPG溶液：准确称取PNPG粉末0.15 g，用磷酸缓冲液溶解，并定容至100 mL，得到浓度为5 mmol/L的标准底物溶液；

(3)α-葡萄糖苷酶溶液：用磷酸缓冲液将α-葡萄糖苷酶配置成1 U/mL的酶液。

(4)Na2CO3溶液的配置：准确称取Na2CO3粉末21.2 g，用蒸馏水定容至1000 mL，配置成0.2 mol/L的Na2CO3溶液，用于终止反应。

(5)配置一定浓度梯度的桦褐孔菌提取物溶液备用，如表1所示。

表1　桦褐孔菌提取物与阿卡波糖溶液浓度梯度Table 1　Inonotus extract and acarbose solution concentration gradient

(6)取400 μL提取物溶液于试管中，加入α-葡萄糖苷酶液20 μL，于37 ℃条件下保温10 min，再加入PNPG溶液200 μL 启动反应，继续于37 ℃条件下保温30 min后加入4 mL Na2CO3终止酶反应过程。利用紫外分光光度计于405 nm处测定吸光值，以蒸馏水作为参比溶液，每组试验平行测定三次。样品吸光值记为A1；以磷酸缓冲液代替多糖溶液作为空白对照，测定吸光值记为A0；以磷酸缓冲液代替PNPG溶液，测定多糖溶液的本底吸光值，记为A2。

体外α-葡萄糖苷酶活性抑制率公式：抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

2　结果与讨论

本实验的原理为α-葡萄糖苷酶能够作用于4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(PNPG)，并将其分解为对硝基酚(PNP)和葡萄糖(G)。PNP为黄绿色物质，并且在405 nm处有最大吸收峰，α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制酶的活性，抑制剂存在时，分解PNPG产生PNP的量就会减少，并且随着抑制剂浓度增加，PNP的量会减少，继而测得的吸光值也会减小。所以，在一定时间内，可以通过测定PNP的含量变化，来计算抑制剂样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

利用不同有机溶剂和水对桦褐孔菌子实体粗粉进行提取，最终得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物和粗多糖部分。四种提取物及阿卡波糖进行体外α-葡萄糖苷酶活性测定，实验结果如下：

2.1不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由图2～图5可得：石油醚提取物的IC50约为1.0 mg/mL；乙酸乙酯提取物的IC50约为0.6 mg/mL；正丁醇提取物的IC50约为0.98 mg/mL；粗多糖的IC50约为0.15 mg/mL。从图2～图5中可以看出，四种提取物的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果与浓度具有一定的相关性。在相同浓度下，各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为：粗多糖部分>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物。综上，由实验结果可得，桦褐孔菌子实体提取物具有良好的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图2　石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig.2　Petroleum ether extract inhibition of α-glucosidase

图3　乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig.3　Ethyl acetate extract inhibition of α-glucosidase

图4　正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig.4　Butanol extract inhibition of α- glucosidase

图5　粗多糖部分对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig.5　Polysaccharide partial inhibition of α-glucosidase

2.2阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果

阿卡波糖降血糖的作用机制为可在肠道内竞争性抑制葡萄糖苷水解酶的活性，进而能够减缓进餐后体内糖的吸收速度，降低饭后血糖的浓度，可在一定程度上治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病。

以阿卡波糖作为阳性对照，分别测定一定浓度阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，结果见图6。由图6可得：阿卡波糖的IC50约为20 mg/mL。

结果表明四种不同溶剂提取物的IC50值都比阿卡波糖的IC50值低，说明四种不同溶剂提取物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并且桦褐孔菌多糖部分相比其他部分对α-葡萄糖苷酶有更强的抑制效果。

图6　阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig.6　Acarbose inhibition of α-glucosidase

3　结　语

本实验中所涉及的粗多糖均未经分离纯化，因此各提取物虽均表现出降糖活性，但并不能明确说明是何种成分在起作用。因此在后续研究中，可以对粗多糖中各成分分别纯化并鉴定其结构以判断桦褐孔菌降糖药物的构效关系。其次，目前的工作仅限于体外活性实验，因此可以对经分离纯化的桦褐孔菌粗多糖进行动物活体实验，筛选出活性更明确的单体成分并进行结构鉴定。

[1]钟秀宏,孙艳美,郑楷,等.桦褐孔菌多糖药理活性研究进展[J].上海中医药杂志,2016(01):94-97.

[2]姚雪松,弥春霞.药用真菌桦褐孔菌的研究进展[J].吉林农业,2016(01):80.

[3]顾今,杨开,叶帮伟,等.食(药)用菌抗糖尿病研究进展[J].中国食用菌,2010(01):7-10.

[4]高愿军,张家泉,王娟娟,等. 桦褐孔菌多糖口服液降血糖作用研究[J].食品科技,2010(07):93-95+99.

[5]陈小平,齐昆青,程团结,等.维格列汀与阿卡波糖对2型糖尿病患者降血糖的临床疗效比较[J].河南医学研究,2013(02):208-210.

Research onInonotusobliquusExtracts in α-glucosidase Activity*

SHENXin-yi,DIAOMiao-lu,FANGYu-lu,ZHANGMeng-ting,CHENTao,ZHUChang-jun

(College of Biological and Chemical Engineering, Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314001, China)

Inonotusobliquusfruiting body was used for experiment material, to explore the effect of its extract on the α-glucosidase enzyme activity.Inonotusobliquusfruiting bodies were extracted with different solvents and α-glucosidase activity inhibition rate were measured with the extracts. Results showed that IC50values of four kinds of extracts, such as petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol and polysaccharide, were 1.0 mg/mL, 0.60 mg/mL, 0.98 mg/mL and 0.15 mg/mL, respectively, IC50values of acarbose was 20 mg/mL. Active ingredient inInonotusobliquushad significant hypoglycemic effect, the polysaccharide had the most significant inhibitory effect to α-glucosidase activity.

Inonotusobliquusfruiting bodies; extraction; α-glucosidase; hypoglycemic

2016年度浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(编号：2016R41707)；2015年嘉兴学院大学生创新创业训练计划项目(编号：851715060)。

沈心怡(1995-)，女，生物工程专业。

Q55

A

1001-9677(2016)018-0059-03