家兔日粮添加小花棘豆黄酮的安全性研究

王帅，杨玲，贾琦珍，陈根元，张玲

（塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）



科学实验研究

家兔日粮添加小花棘豆黄酮的安全性研究

王帅，杨玲，贾琦珍，陈根元，张玲*

（塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）

为研究小花棘豆黄酮对家兔采食及代谢指标的影响，探讨小花棘豆黄酮作为饲料添加剂使用的前景，本试验将24只家兔随机分为4组，对照组和3个试验组，其中对照组仅饲喂配合饲料，试验组饲料中分别添加10、30、50 mg/kg剂量的黄酮，试验期60 d。每10 d测定一次家兔采食量和体质量，第60天屠宰后测定脏器系数及形态学变化，并检测血液学指标与血清生化指标。结果显示，家兔采食小花棘豆黄酮后未见异常临床症状，镜检家兔器官正常；试验组家兔脏器系数和血液生理生化指标均无异常变化，其中试验Ⅱ组和试验Ⅲ组家兔血清丙二醛（MDA）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和极低密度脂蛋白（VLDL-C）含量显著低于对照组（P＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量均显著高于对照组（P＜0.05）。结果表明适量添加小花棘豆黄酮不会导致家兔中毒，还可降低血脂和自由基含量，提高血清抗氧化酶活性，具有一定保肝作用。

小花棘豆；黄酮；家兔；利用

小花棘豆（Oxytropis glabra DC）又名醉马草、马绊肠、绊肠草等，在新疆分布广泛。据哈萨克药典记载，小花棘豆具有镇痛、抗炎等作用，可用于治疗牙痛、关节炎、神经衰弱，具有良好的研究前景（王帅等，2014）。小花棘豆化学成分复杂，目前研究表明，黄酮是其活性成分之一。王帅等（2012）测定发现小花棘豆黄酮含量显著高于传统藏药“达夏”（镰形棘豆），进一步试验证实其具有较好的抗脂质氧化作用，可开发为天然抗氧化剂。贾琦珍等（2014）研究表明，小花棘豆黄酮可提高肉仔鸡总抗氧化能力及血清抗氧化酶活力，并降低血清自由基含量，有效抑制热应激对肉仔鸡造成的损伤。王帅等（2015）研究发现，绵羊适量饲喂小花棘豆黄酮可适当提高纤维素利用率，而且对瘤胃原虫数量及纤维素降解菌群无不良影响。本试验拟在家兔日粮中添加不同剂量的小花棘豆黄酮，通过分析试验家兔血液指标及内脏组织形态学的变化，研究小花棘豆黄酮对家兔机体的影响，探讨小花棘豆黄酮作为抗氧化饲料添加剂的安全性。

1　材料与方法

1.1试验材料小花棘豆黄酮，由实验室自行提取，有效成分含量＞95%。

血液生化指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和极低密度脂蛋白（VLDL-C）检测试剂及配套校准品，购自北京利德曼生化股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）检测试剂盒，购自南京建成生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯。

7180型全自动生化仪（日立仪器苏州公司）、CelltacEMEK-7222K型全自动血细胞分析仪（日本光电工业株式会社）、T6型紫外-可见光分光光度计（北京普析通用仪器公司）、CX31型生物显微镜（日本奥林巴斯株式会社）、BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司）、5427R型高速冷冻离心机（德国艾本德公司）。

1.2试验设计将24只家兔随机分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，每组6只家兔。对照组仅饲喂配合饲料，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂含有小花棘豆黄酮10、30、50 mg/kg的混合饲料，自由饮水。试验期60 d。

1.3试验日粮与管理对照组家兔日粮参考王帅等（2013）的研究，结合本地饲草料资源，再补充食盐、添加剂、赖氨酸、蛋氨酸等配制而成，精料组成及营养水平见表1。试验组日粮将小花棘豆黄酮按10、30、50 mg/kg的比例与原料充分混合后制备颗粒饲料。所有家兔均自由采食和饮水，每天记录家兔的饮食状况、精神状态、采食量及体质量的变化。

表1　精料配方及营养水平

1.4家兔血清生化指标的测定末次饲喂3 h后所有试验家兔采血，部分3000 r/min离心分离血清。其中ALT、AST、LDH、AKP、CR、BUN、TG、TC、GLU、TP和ALB使用生化仪检测；SOD、GSHPx、CAT和MDA按照试剂盒说明书采用分光光度计检测。部分通过改良哈贝尔序列超速离心分离法分离血脂蛋白，测定指标包括：HDL-C、LDL-C和VLDL-C。

1.5家兔血液学指标的测定血液学指标使用全血测定，检测指标有：白细胞数（WBC）、淋巴细胞数（LYM）、嗜酸性粒细胞数（EOS）、嗜碱性粒细胞数（BASO）、嗜中性粒细胞数（NEU）、单核细胞数（MONO）、红细胞数（RBC）、血红蛋白质量浓度（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白质量（MCH）、平均红细胞血红蛋白质量浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、血小板数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板平均体积（MPV）、血小板平均分布宽度（PDW）。

1.6家兔脏器系数测定及器官组织学观察取家兔内脏，准确称量记录各脏器重量，计算脏器系数。将取出的内脏置于10%的中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，间隔连续切片，HE染色，显微镜观察试验家兔器官的组织学变化。脏器系数计算公式为：

1.7数据分析试验数据通过SPSS16.0的One-Way ANOVA进行单因素方差分析及Duncan’s多重比较，检验误差分别为5%和1%。

2　结果与分析

2.1试验期家兔采食量的变化试验期内对照家兔和试验家兔均未见异常，没有表现出明显的中毒症状。由表2可见，随着小花棘豆黄酮添加量的增大，试验家兔采食量呈现上升趋势，第60天时，试验Ⅲ组家兔采食量较对照组提高38.25%（P＜0.05）。说明小花棘豆黄酮长期饲喂可有效提高家兔的采食量。

表2　小花棘豆黄酮对家兔采食量的影响g

2.2试验期家兔体质量的变化由表3可见，试验前期（0～30 d）小花棘豆黄酮饲喂组家兔体质量与对照家兔差异不明显，但从第40天起小花棘豆黄酮饲喂组家兔体质量均高于对照家兔，但整个试验期内试验组体质量与对照组家兔体质量无显著差异（P＞0.05）。表明日粮中适量添加小花棘豆黄酮可促进家兔增重，原因可能与采食量增加有关。

表3　小花棘豆黄酮对家兔体质量的影响

2.3家兔血液生化指标测定结果由表4可知，试验组家兔血清AST、ALT、AKP、HDL、CAT、BUN、CR、GLU、TG、HDL-C、TP和ALB含量均与对照组差异不显著（P＞0.05）。表明日粮中适量添加小花棘豆黄酮不会影响家兔的肝功与肾功指标。另外试验Ⅱ组家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量分别下降19.06%、19.21%、30.02%和27.54%，试验Ⅲ组家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量分别下降了25.81%、21.37%、34.16%和35.53%（P＜0.05），试验Ⅱ、Ⅲ组家兔血清SOD和GSH-Px活性分别升高了21.26%和28.01%、27.01%和36.45%（P＜0.05），表明日粮中添加一定量的小花棘豆黄酮可以提高家兔机体的抗氧化物酶活性，降低血液中的自由基水平，并可改善家兔对脂肪的利用情况。

表4　家兔血清生化指标测定结果

2.4家兔血液学指标测定结果由表5可知，试验Ⅲ组家兔血液中LYM、RBC、HGB、HCT、MCV和MCH值分别升高了21.52%、21.43%、23.63%、26.21%、23.30%和31.37%（P＜0.05），但其余指标均与对照家兔差异不显著（P＞0.05）。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组家兔各项血液学指标均与对照家兔差异不显著（P＞0.05）。试验结果表明家兔日粮中添加小花棘豆黄酮对血液学指标无不良影响，50 mg/kg的剂量还可有效增强家兔机体免疫力，并改善家兔血液的运氧能力。

2.5家兔脏器系数及器官组织学检测结果由表6可知，试验组家兔肝脏指数、肾脏指数、心脏指数、脾脏指数、胰脏指数、脑指数、胃指数和肠道指数与对照家兔均差异不显著（P＞0.05）；镜检观察未发现家兔组织器官出现细胞空泡变性，细胞核坏死、溶解、消失等异常变化。

3　讨论

3.1小花棘豆黄酮对家兔采食量及体质量的影响研究发现小花棘豆黄酮主要为黄酮苷，苷元包括鼠李素、异鼠李素、鼠李柠檬素、甲基鼠李素、槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、白杨素等。本试验在家兔日粮中添加了不同剂量的小花棘豆黄酮，通过60 d的饲喂试验，发现小花棘豆黄酮长期饲喂可提高家兔的采食量，高剂量组可显著提高家兔的采食量，并有效提高了试验家兔的体质量，试验期内未见家兔发生明显的中毒反应。表明适量饲喂小花棘豆黄酮不会导致家兔中毒。饲喂小花棘豆黄酮未引起试验家兔和对照家兔体质量的显著差异。其原因可能是小花棘豆黄酮的饲喂剂量较小，可能没有达到使家兔体质量发生明显变化的剂量。

表5　家兔血液学指标测定结果

表6　家兔主要脏器指数测定结果%

3.2小花棘豆黄酮对家兔血液生化指标的影响AST和ALT是衡量肝功的重要检测指标，AKP和HDL可用于检测动物机体实质性内脏器官的损伤；TP和ALB反映了机体血液中蛋白质的含量，而BUN和CR是机体蛋白质的代谢产物；GLU可用于检测机体糖代谢水平；TG、TC、HDL-C、LDLC和VLDL-C反映了动物机体的血脂情况（Martens和Mithofer，2005）。SOD、GSH-Px和CAT是机体重要的抗氧化酶，MDA是氧自由基的主要代谢产物，这4个指标可用于评价机体抗氧化能力的变化。试验研究发现，小花棘豆黄酮饲喂组家兔血清AST、ALT、AKP、BUN、LDH、GLU、CR、TG、TP、HDL-C和ALB含量均与对照组差异不显著（P＞0.05），表明饲喂小花棘豆黄酮未引起动物肝功、肾功等异常变化，与张玲等（2013）研究结果一致；另外中剂量和高剂量试验家兔血清MDA、TC、LDL-C和VLDL-C含量均显著低于对照组（P＜0.05），SOD和GSH-Px活性均显著高于对照组（P＜0.05），表明日粮中添加一定量的小花棘豆黄酮可以提高家兔机体的抗氧化物酶活性，降低血液中的自由基水平，并可改善家兔对脂肪的利用情况，具有较好的研究前景和价值。

3.3小花棘豆黄酮对家兔血液学指标的影响LYM主要在机体免疫反应中发挥作用，是机体免疫力的重要评价指标。MCV和MCH主要反映红细胞的形态，可用于检测血红蛋白的生成与红细胞分化增生；RBC和HGB反映了血液中红细胞和血红蛋白的数量，可用于评价血液运氧能力与抗氧化能力（Mitsuyoshi等，2005）。本试验表明，高剂量的小花棘豆黄酮可显著提高家兔血液中淋巴细胞、红细胞及血红蛋白数量值，说明小花棘豆黄酮具有提高免疫力和改善血液携氧能力的作用。

3.4小花棘豆黄酮对家兔脏器系数的影响脏器系数可反映受试物脏器的损害程度（张玲等，2013）。但脏器系数的变化只能说明动物的某个脏器可能受到损伤，确诊仍需进一步的病理组织学和相关生理生化指标的检查。试验结果发现，试验家兔和对照组家兔各实质性脏器及消化器官系数均无显著差异，镜检未发现异常。说明小花棘豆黄酮可被家兔安全吸收利用。

4　结论

在60 d的家兔饲喂试验中，通过临床症状观察及体质量增重情况、血液生化指标和血液学指标以及脏器系数比较，未发现饲喂小花棘豆黄酮的家兔出现中毒症状。结果表明，小花棘豆黄酮可有效提高家兔血液抗氧化酶活性，降低血脂和自由基含量，具有增强免疫力和一定的保肝作用，可作为饲料添加剂应用。

［1］贾琦珍，陈根元，王帅，等.小花棘豆黄酮对热应激肉仔鸡抗氧化能力的影响［J］.中国饲料，2014，17：14～17.

［2］王帅，蒋慧，陈根元，等.小花棘豆总黄酮体内抗氧化作用的研究［J］.中国畜牧兽医，2012，39（10）：133～136.

［3］王帅，陈根元，张玲，等.小花棘豆对家兔血液生化指标的影响［J］.中国兽医科学，2013，43（2）：190～196.

［4］王帅，张玲，陈根元，等.小花棘豆生态学研究概况［J］.家畜生态学报，2014，35（3）：85～88.

［5］王帅，贾琦珍，陈根元，等.小花棘豆黄酮对瘤胃原虫和纤维素降解菌的影响［J］.中国饲料，2015，6：11～13.

［6］张玲，陈根元，吴书奇，等.小鼠日粮中添加小花棘豆黄酮的安全性试验［J］.中国畜牧兽医，2013，40（1）：99～102.

［7］Martens S，Mithofer A.Flavones and flavone synthases［J］.Phytochemistry，2005，66（20）：2399～2407.

［8］Mitsuyoshi M，Naoko S，Kotaro S，et al.Cytotoxicity of flavornoids toward cultured normal human cells［J］.Bio Pharm Bull，2005，28（2）：253.

The main goal of this experiment was to investigate the clinical safety on feeding flavonoid from Oxytropis glabra DC for rabbit，then reveal the utilization of flavonoid from O.glabra DC in future.A total of 24 rabbits were randomly and equally divided into control group and experimental groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ.There were 6 rabbits in each group（3 male rabbits and 3 female rabbits）.The control group were fed complete feed，different amounts of flavonoid from O.glabra DC（10，30，50 mg/kg）were mixed with the feeds in three experimental groups，the trial period was 60 d.Every 10 d the feed intake and body quality of rabbits were measured，the pathomorphological changes and coefficient of organ in rabbits were also observed，finally the hematological indices and serum biochemical indicators were tested after slaughter.The result showed that fed flavonoid from O.glabra DC didn’t show any abnormal clinical diseases，toxic symptom hadn’t been observed in organ by microscopic examination，the serum biochemical indicators，hematological indices and quots of organ was in normal limits.The contents of maleic dialdehyde（MDA），total cholesterol（TC），LDL-cholesterol（LDL-C）and VLDL-cholesterol（VLDL-C）in experimental groupⅡ，Ⅲwere significantly lower than those of control group（P＜0.05）. The contents of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in experimental groupⅡ，Ⅲwere significantly higher than those of control group（P＜0.05）.It showed that flavonoid from O.glabra DC in forage had no subchronic toxicity and good safety to rabbit，and was good to reduce free radical and blood fat in rabbit.It had liver protection of feeding flavonoid from O.glabra DC in forage for rabbit.

Oxytropis glabra DC；flavonoid；rabbit；utilization

S816.7

A

1004-3314（2016）07-0009-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160702

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD17B05）；新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题（HS201402）