惠阳胡须鸡LPL、FASN基因多态性的研究

李红伟，陈　圆，鲍　淼，田庆庆，贺　扬, 苏耀辉, 邹志冠

(1.惠州学院生命科学系，广东　惠州　 516007；2. 广东金种农牧科技股份有限公司, 广东　惠州　 516007)



惠阳胡须鸡LPL、FASN基因多态性的研究

李红伟1，陈圆1，鲍淼1，田庆庆1，贺扬1, 苏耀辉2, 邹志冠2

(1.惠州学院生命科学系，广东惠州 516007；2. 广东金种农牧科技股份有限公司, 广东惠州 516007)

以惠阳胡须鸡为研究对象, 分别以LPL、FASN基因为脂肪性状相关的候选基因, 采用限制片段长度多态性(RFLP)检测这2个候选基因在惠阳胡须鸡中的多态性。研究结果表明，(1) 用限制性内切酶HinfⅠ对LPL 基因第8 内含子进行RFLP分析，发现76.3%为已报道的BB型，另发现了两种新的基因型，分别占1.7%和22%，无AA型; (2) 用限制性内切酶HaeⅢ对FASN基因进行RFLP分析,发现BB基因型比例为64.8%，BC型12.24%，CC型基因型比例23.4%。B等位基因频率为0.7041，C等位基因频率为0.2959，B等位基因频率明显高于C等位基因频率。

惠阳胡须鸡；LPL基因;FASN基因; 限制片段长度多态性

惠阳胡须鸡，又名三黄胡须鸡、龙岗鸡、龙门鸡、惠州鸡，具有胸肌发达、肉质佳但生长速度慢等特点。研究表明，脂肪酸合成酶(FASN)与脂肪性状紧密相关,在很大程度上决定肉的嫩度、风味和多汁性[1]。Graciela等[2]在Campero肉鸡品系群体中对FASN基因进行测序、PCR-RFLP分析，提出FASN是脂肪性状的候选基因。欧阳建华等[3]研究了FASN基因单核苷酸多态性与鸡体重、脂肪沉积性状的关系，表明2个多态性位点与鸡体重、脂肪沉积性状存在一定的相关性。

脂蛋白酯酶(Lipoprotein Lipase, LPL)是参与脂肪代谢的关键酶[4]。已有研究表明, 肌内脂肪含量与肉的嫩度和风味密切相关, 是影响鸡肉质一个重要因素[5]。LPL 在脂类代谢过程中有着重要的生理和生物学功能, 可能是影响肌内脂肪含量的候选基因。

本研究旨在通过研究胡须鸡中LPL、FASN基因多态性，为今后基因型选择以及提高胡须鸡的养殖经济效益奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

鸡血样采自广东金种农牧科技股份有限公司惠阳胡须鸡保种场。

1.2试验方法

1.2.1总DNA的提取采用北京汇天东方科技有限公司小量全血基因组DNA快速提取试剂盒提取, 提取步骤按试剂盒说明。

1.2.2电泳检测用琼脂糖凝胶电泳对DNA样品及PCR产物进行检测，电泳体系如下：琼脂糖凝胶浓度1.2%(1.2 g琼脂糖，100 mL 1×TBE，2 μL Goldview染料)，电泳液1×TBE(108 g Tris，55 g硼酸，0.5 mol·L-1EDTA(pH8.0)40 mL加蒸馏水至1 000 mL后稀释10倍)，6×Loading buffer 1 μL与DNA样品1 μL混匀点样，电压100 V，电泳80 min后，在WD-9413A凝胶成像分析仪下观察电泳条带。

1.2.3PCR反应采用北京鼎国生物技术有限责任公司的2×TaqPCR Green Mix试剂盒进行PCR， PCR反应体系：2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL；DNA模板 0.5μL；上游引物 0.25μL；下游引物 0.25μL；Nuclease-Free 水 11.5 μL。

LPL基因扩增程序：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，经35个循环，72℃延伸10 min。FASN基因扩增程序：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，经35个循环，72℃延伸10 min。

1.2.4LPL基因PCR扩增产物的HinfⅠ酶切酶切体系为12 μL，包括以下成分：8 μL PCR产物，1.2 μL 10×Buffer，2.3 μL 灭菌水，0.5 μL HinfⅠ酶。37℃恒温水浴锅40 min，80℃10 min灭活酶。酶切产物用1.2%凝胶琼脂糖电泳检测，观察结果。

1.2.5FASN基因PCR产物的HaeⅢ酶切酶切体系为20 μL，包括以下成分：10.0 μL PCR扩增产物，2 μL 10×Buffer，1 μL HaeⅢ酶，7 μL 灭菌水。37℃恒温消化3 h，用2%凝胶琼脂糖电泳检测酶切产物。

2　结果与分析

2.1DNA提取结果

采用北京汇天东方科技有限公司小量全血基因组DNA快速提取试剂盒，取20 μL血样提取基因组 DNA。如图1 所示，电泳条带较为清晰，说明本试验提取的DNA 完整性较好，纯度和浓度都较高，可用于后续的PCR扩增。

2.2PCR扩增结果

从图2 可知，LPL基因 PCR扩增目的片段约为1.5 kb，与潘爱銮等[4]研究报道一致。并且每一个胶孔的DNA荧光带都很明显，说明PCR效果比较理想，所得到的PCR产物可用于下一步酶切试验。由图3可以看出，FASN基因片段，扩增片段较清晰，可以确定本次PCR扩增结果，长度与预期结果一致，产物无杂带，可以做下一步的酶切反应。

2.3酶切结果分析

用HinfⅠ的酶对LPL基因PCR扩增产物进行酶切结果如图4。在59个样品中有45个样品为已知基因型种类BB型，分别是1～20、22～54以及44，共占76.3%。并未发现AA型。

HaeⅢ酶切结果电泳图，如图5所示, FASN基因有3种基因型。参照欧阳建华等的鉴定方法[3]BB基因型具有780、340、305 bp 3条带; CC基因型具有780、340、240、65 bp 4条带; BC基因型具有780、340、305、240、65 bp 5条带，其中65 bp条带在凝胶上不可见。

2.4LPL基因型频率分析

LPL的基因型存在3种基因型，其中已知BB型，新发现2种基因型，因此，表明惠阳胡须鸡中LPL基因不处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.5FASN基因型频率分析

惠阳胡须鸡的FASN的基因型应用Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验方法，结果如表1所示，按自由度=2，查x2界值表得P<0.05，表明惠阳胡须鸡群体中的FASN基因不处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表1　FASN基因型的卡方检验

3　讨　论

在本研究中，通过LPL基因的RCR-RFLP分析发现，主要为BB型个体，共占76.3%，并未发现AA型个体。而在潘爱銮等[4]6个品种鸡LPL基因的RCR-RFLP分析发现A基因频率占优势，并且与其他品种间的基因型分布差异达到了极显著水平。说明了本次试验结果和潘爱銮等研究结果不一致。这可能是遗传背景不同造成，说明在该公司惠州胡须鸡保种群体B基因频率占优势。第21号样品出现未知基因型一，其基因频率占1.7%；这可能是突变导致的新基因型，这与AA、AB、BB型都不一样，需要进一步测序检测分析，才能了解该基因型。第40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53号样品呈现未知基因型二，其基因频率占22%，从电泳结果表明这些个体的DNA的PCR产物用HinfⅠ酶切不开, 这可能是新的突变导致酶切位点的改变，需要进一步深入研究。

FASN基因型和等位基因频率统计结果表明，惠州胡须鸡以BB基因型和B等位基因占明显优势，频率分布分别为0.642 8和0.704 1。魏伍川等[6]研究了湛江三黄鸡FASN不同基因型与腹脂肪性状的相关性, 结果表明FASN基因位点为CC基因型个体的腹脂率低于BB和BC基因型鸡的。而以往的研究报道[2]表明，BB基因型脂肪沉积能力强且增重快，所以在进一步的研究中，需要做不同基因型与胡须鸡生长性状之间的关联分析，找出增重较快的优势基因型，应用于基因型选择。

[1]魏伍川，刘欣，陈耀玲. 湛江三黄鸡2个脂肪性状相关基因的多态性及其与屠宰腹脂性状的相关分析[ J].广州农业科学，2013，(2): 95-98.

[2]GRACIELA M, FELISAROZEN, GABRIEL B D, et al. New polymorphism of FASN gene in chicken[J]. JAppl Genet, 2004, 45:453-455.

[3]欧阳建华,谢亮, 刘杰,等.鸡FASN基因2个位点的多样性及其与体重、脂肪沉积性状的相关性[ J]. 畜牧兽医学报, 2007, 38(1): 25 - 30.

[4]潘爱銮，6个品种鸡LPL基因的RCR-RFLP分析[J]，中国家禽,2004，8(1)：152-154.

[5]李俊英, 李慧锋, 姜润深, 等. 优质鸡肌内脂肪含量与屠体及肉质性状间的关系[ J]. 中国畜牧杂志, 2004,40(12)： 12-15.

[6]魏伍川，林丽清，杨清莲. 鸽FASN基因的部分序列测定及其与家鸡同源序列的比较[J].湛江师范学院学报, 2013,3:103-108.

(责任编辑：林海清)

Restriction Fragment Length Polymorphism of LPL and FASN Genes in Huiyang Bearded Chicken

LI Hong-wei1, CHEN Yuan1, BAO Miao1, TIAN Qing-qing1, HE Yang1,SU Yao-hui2,ZOU Zhi-guan2

(1.DepartmentofLifeScience,HuizhouUniversity,Huizhou，Guangdong516007,China; 2.GuangdongJinzhongAnimalHusbandryCO.,Ltd,Huizhou，Guangdong516021,China)

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) of LPL and fatty acid synthetase (FASN) genes in Huiyang bearded chickens was obtained to facilitate the selection for dominant genotypes associated with the high-quality meat and fast-growing characteristics in chicken. Genomic DNA was extracted from the chicken blood. The two genes of interest were amplified by PCR. The amplied product of LPL gene was digested by Hinf I,and FASN gene by Hae III, for RFLP analysis. The results showed that (1) in LPL gene,the genotype BB was76.3%,while the two newly discovered genotypes were 1.7% and 22%, with no AA type detected; (2)in FASN gene, genotype BB， CC, and BC were 64.8%, 23.4%, and 12.24%, respectively,while the frequencies of B and C genes were0.7041 and 0.2959, respectively.

Huiyang bearded chickens；LPL gene；FASN gene；restriction fragment length polymorphism；

2015-12-18初稿；2016-06-02修改稿

李红伟(1972-),男,博士,讲师,主要从事家禽遗传育种研究(E-mail:lhwcau@163.com)

广东省普通高校特色创新项目(自然科学类)(2014KTSCX178); 惠州学院博士启动基金(156020021)

S 831

A

1008-0384(2016)07-690-04

李红伟，陈圆，鲍淼，等.惠阳胡须鸡LPL、FASN基因多态性的研究[J].福建农业学报，2016，31(7)：690-693.

LI H-W，CHEN Y，BAO M，et al.Restriction Fragment Length Polymorphism of LPL and FASN Genes in Huiyang Bearded Chicken[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：690-693.