HPLC法测定三华李花色苷的成分及含量

黄月，黄苇，李媛

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

HPLC法测定三华李花色苷的成分及含量

黄月，黄苇*，李媛

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

三华李果实富含红色素，对其红色素的主要成分进行了定性和定量测定，明确其结构和含量，为三华李的加工利用提供参考。采用WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：乙腈，B：4%甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0min～25min，6%A～16%A。检测波长520nm，柱温箱40℃，流速1mL/min。试验结果表明三华李果实中红色素主要为矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，矢车菊素-3-半乳糖苷未检出。外标法定量，前二者的含量分别为87.26mg/kg和32.41 mg/kg。两种花色苷在0.000 5 mg/mL～0.100 0 mg/mL范围内线性关系良好，标准曲线的决定回归系数R2分别为0.9999和0.9998。两种花色苷的加标回收率均大于95%，相对标准偏差（RSD）分别为1.93%和2.40%。样品重复性好，进样峰面积相对标准偏差小于等于1.23%。本方法简便可行，结果可靠，适用于三华李花色苷成分和含量的测定。

三华李；花色苷；高效液相色谱

三华李为蔷薇科李属植物，最早因在广东省韶关市翁源县三华乡种植而得名［1］。三华李红皮红肉，酸甜适宜，是鲜食和加工的良好材料。呈现红色、紫红或者紫黑的水果多含有花色苷，花色苷是由花色素和糖以糖苷键形式结合的化合物，属于黄酮类化合物，具有典型的C6-C3-C6结构，是广泛分布于自然界的水溶性天然食用色素［2］。花色素主要有矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素等六大类，不同的花色素和不同的糖结合，形成了不同花色苷的颜色差异。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，具有很好的着色力，并且具有多种功效，如抗氧化、抗变异、抗肿瘤、预防糖尿病、保护视力、抗动脉粥样硬化、防治心血管疾病和抑制血小板凝集等［3-7］。近年来，针对红树莓、桑葚、蓝莓、血橙等果实的花色苷研究较多。李果实呈红色的主要物质也是花色苷类色素［8］，已有研究显示，中国李、欧洲李、樱桃李等多种李中的花色苷，主要为矢车菊花色苷和少量天竺葵花色苷，矢车菊花色苷又以矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷等为主［8-10］。目前有关广东三华李红色素开展的研究，多针对其提取方法和抗氧化作用，均是通过最大吸收波长来初步确定红色素为黄酮类花色苷化合物［1，3］，鲜见对三华李花色苷结构和含量进行准确的定性和定量分析。

花色苷在可见光区的最大吸收波长是520 nm［11］。本试验采用高效液相色谱法对三华李花色苷进行测定，明确其主要花色苷的结构和含量，为开发和综合利用广东省特色水果三华李提供一定的参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1原材料

三华李：采自广州市从化区龙丰园果子食品厂吕田水果生产示范基地。

1.1.2试剂与耗材

色谱纯矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanin-3-glucoside）、矢车菊素-3-芸香糖苷（cyanin-3-rutinoside）和矢车菊素-3-半乳糖昔（cyanin-3-galacoside）：德国sigma公司。色谱纯甲醇、乙腈：hollywell公司；色谱纯甲酸、分析纯盐酸：天津市科密欧化学试剂有限公司。C18 Sep-Pak小柱：美国Waters公司。

1.1.3仪器

LC-15C高效液相色谱仪：日本岛津公司；SHZ-3循环水真空泵：上海锦华层析设备厂；ALC-210.2电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HS-6150超声波清洗器：北京恒奥德仪器仪表有限公司。

1.2方法

1.2.1色谱条件

岛津C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：乙腈，B：4%甲酸溶液，梯度洗脱程序：0 min～25 min，6%A～16%A。检测波长520 nm，柱温箱40℃，进样量为20 μL，流速1 mL/min。外标法定量。

1.2.2标准溶液的配制

精密称取花色苷标准品1mg，甲醇溶解定容于5mL棕色容量瓶中，摇匀作为储备母液，低温避光保存。

1.2.3样品的制备

花色苷在偏酸性的条件下才能保持其2-苯基-苯并吡喃阳离子结构。提取方法参照Wang Yan等［10］的方法并加以改进，称取果肉5 g，经研磨后加入20 mL的0.1%盐酸甲醇，4℃放置于冰箱静置提取20 h，然后超声波提取20 min，过滤去渣，用浸提液冲洗滤渣。合并提取液，37℃真空旋转蒸发，4%甲酸水溶液回溶残余物。

提取物用6 mL/500 mg C18 Sep-Pak小柱进行纯化。小柱活化：18mL甲醇，流速3 mL/min～5 mL/min；冲洗：20mL 0.1%的盐酸水溶液，流速3mL/min～5mL/min；样品上柱；冲洗：20 mL 0.1%的盐酸水溶液，流速1 mL/min～2 mL/min；洗脱：20 mL 0.1%的盐酸甲醇溶液。将纯化后的花色苷样品37℃真空旋转蒸发，4%的甲酸水回溶残余物，定容至10 mL，过0.22 μm有机膜，低温保存。

2结果与分析

2.1标准曲线和线性范围

将标准品母液，用4%甲酸水稀释成0.000 5、0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0 mg/mL的标准溶液。按照1.2.1的色谱条件进行测定。以峰面积（y）为纵坐标，浓度（x）为横坐标，建立标准曲线。标准品色谱图见图1，标准曲线见图2～图4。

图1　花色苷标准品色谱图Fig.1Anthocyanins standard liquid chromatogram

图2　矢车菊素-3-半乳糖苷标准曲线Fig.2The standard curve of cyanin-3-galacoside

图3　矢车菊素-3-葡萄糖苷标准曲线Fig.3The standard curve of cyanin-3-glucoside

2.2精密度试验

图4　矢车菊素-3-芸香糖苷标准曲线Fig.4The standard curve of cyanin-3-rutinoside

将同一份0.020 0 mg/mL标准品重复进样6次，按照1.2.1色谱条件测定，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。如表1所示，矢车菊素-3-半乳糖苷（A）、矢车菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢车菊素-3-芸香糖苷（C）的RSD分别为1.02%、1.07%、0.93%，表明在该色谱条件下精密度良好。

2.3样品花色苷的测定

按照1.2.3方法提取和纯化三华李花色苷后，经色谱柱分离得到的色谱图如图5所示。

表1　精密度试验结果Table 1Results of precision test

图5　三华李花色苷色谱图Fig.5Chromatography of anthocyanin in Sanhua plum

将样品与标准品的色谱峰保留时间相对照，样品色谱图中的色谱峰鉴定依次为矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，分子结构见图6［11］。经计算，三华李果实中矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量为87.26 mg/kg，矢车菊素-3-芸香糖苷的含量为32.41 mg/kg，矢车菊素-3-半乳糖苷未检出。

图6　矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷的分子结构Fig.6The molecular structure of cyanin-3-glucoside and cyanin-3-rutinoside

2.4重复性试验

精密称取同一批三华李样品5份，各5 g，按照1.2.3提取和纯化样品。经测定，矢车菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢车菊素-3-芸香糖苷（C）峰面积的相对标准偏差RSD分别为1.23%和0.98%，见表2。表明样品花色苷在该方法下重复性良好。

表2　重复性试验结果Table 2Results of repeatability test

2.5稳定性试验

取一份纯化过膜样品溶液，放置于室温阴暗处，分别于0、1、2、4、8、12、18、24 h，按照1.2.1的方法测定样品，矢车菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢车菊素-3-芸香糖苷（C）峰面积的RSD分别为1.58%和2.08%，见表3。表明样品花色苷在24 h内稳定。

表3　稳定性试验结果Table 3Results of stability test

2.6回收率试验

在已知含量的样品溶液中加入一定量的花色苷对照品，按照1.2.1色谱条件进行测定。矢车菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢车菊素-3-芸香糖苷（C）回收率的相对标准偏差RSD分别为：1.93%和2.40%。表明该方法具有较高的加标回收率和精密度。回收率试验结果见表4。

表4　加样回收率试验结果Table 4Results of recovery ratio

3结论与讨论

本试验采用高效液相色谱法对三华李果实花色苷的主要成分进行了定性和定量测定，显示其花色苷为矢车菊素-3-葡糖糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，含量分别为87.26 mg/kg和32.41 mg/kg，未检出矢车菊素-3-半乳糖苷。本试验采用乙腈和甲酸水溶液做流动相，分离效果较好。线性范围0.000 5 mg/mL～0.1000 mg/mL，方法精密度良好，峰面积RSD小于等于1.07%。加标回收率较高，RSD小于等于2.40%。样品重复性好，进样峰面积RSD小于等于1.23%。表明方法简便可行，结果可靠，适用于三华李花色苷成分和含量的测定。

据报道［8］，矢车菊素-3-葡糖糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷在紫琥珀李果肉中的含量分别为：192.00、89.00 mg/kg；在大石早生李果肉中的含量分别为：82.00、4.00 mg/kg；在芙蓉李果肉中的含量分别为：37.00、49.00 mg/kg。在红树莓中的含量分别为354.27、318.99 mg/kg［12］；野生桑葚的含量分别为1041.63、482.71 mg/kg［13］。三华李矢车菊素-3-葡糖糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷的含量低于紫琥珀李，高于大石早生李和芙蓉李，低于红树莓和桑葚。花色苷是一种天然安全色素，具有抗氧化等多种作用，三华李在广东省广泛种植，平均产量达22 500 kg/hm2～37 500 kg/hm2，果实花色苷含量较高，具有较高的开发利用价值。

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Determination of Anthocyanin Component and Content in Sanhua Plum by HPLC

HUANG Yue，HUANG Wei*，LI Yuan
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

The Sanhua plum is rich in red pigment.Qualitative and quantitative determination of main composition of the red pigment were carred out.Then their structure and content were known，which can provide refer ence for Sanhua plum processing.The samples were detected with WondaSil C18 chromatographic column（4.6 mm×250mm，5microns）under40℃columntemeratureand520nmdetectionwavelength.Themobilephase consisted of acetonitrile（A）and 4%formic acid aqueous solution（B）with linear gradient program of 6%-16%（A）in0min-25min，ataflowrateof1mL/min.Cyanin-3-glucosideandcyanin-3-rutinosidecontentsofSanhua plum were 87.26 mg/kg and 32.41 mg/kg，cyanin-3-galacoside was not checked out.The calibration curves of cyanidin-3-glucoside and cyanin-3-rutinoside were linear in the range of 0.000 5 mg/mL-0.100 0 mg/mL，with 0.999 9 and 0.999 8 R2respectively.Standard addition recovery rate is more than 95%and relative standard deviation were 1.93%and 2.40%respectively.Sample relative standard deviation of peak area is less than or equal to 1.23%，which showed good repeatability.This method is simple and reliable.It's suitable to detect anthocyanins component and content in San hua plum.

Sanhuaplum；anthocyanin；highperformanceliquidchromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.028

2015-03-09

国家科技支撑计划课题（2012BAD31B03）

黄月（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工、包装与保藏。

黄苇（1967—），女，教授，研究方向：食品加工、包装与保藏。